Genetica e genomica - Vol. III - Cap. 17 - Manuale per il docente

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(No Transcript)
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17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Tabella 17.1 Polimorfismo enzimatico nelle piante
da frutto.
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17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Figura 17.1 Procedura per lanalisi di marcatori
enzimatici nelle piante.
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17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Figura 17.2 Marcatori biochimici (A)
fosfo-gluco-mutasi (PGM) (B) lipoossigenasi
(LOX) in soia (C) esterasi (EXT) in poa
pratense (D,E) rappresentazioni schematiche di
isoenzimi e alloenzimi del sistema
leucinoammino-peptidasi (LAP) e perossidasi (POX)
in mais che mettono in evidenza la
tessuto-specificità di questi marcatori.
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17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Figura 17.3 Rappresentazione schematica delle
possibili combinazioni di catene polipeptidiche e
di profili elettroforetici ottenibili con enzimi
monomerici (A), dimerici (B) e tetramerici (C) in
organismi diploidi.
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17.2 MARCATORI MOLECOLARI DEFINIZIONE E
CLASSIFICAZIONI
Figura 17.4 Schema sinottico delle principali
classi di marcatori molecolari utilizzabili per
lanalisi del genoma. La classificazione adottata
si basa sulla tecnica utilizzata (SBH, Southern
Blot Hybridization o PCR, Polymerase
Chain Reaction) e sul numero di loci saggiati
(singolo-locus o multi-locus).
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17.2 MARCATORI MOLECOLARI DEFINIZIONE E
CLASSIFICAZIONI
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17.2 MARCATORI MOLECOLARI DEFINIZIONE E
CLASSIFICAZIONI
Tabella 17.2 Capacità di risoluzione dei gel di
agarosio e poliacrilammide in funzione della
concentrazione di polimero.
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17.2 MARCATORI MOLECOLARI DEFINIZIONE E
CLASSIFICAZIONI
Figura 17.6 Rappresentazione schematica di un
sistema elettroforetico orizzontale con gel di
agarosio (A) e di uno verticale per gel di
poliacrilammide (B).
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17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE
Figura 17.7 Mappatura di restrizione di un
frammento di DNA di 3 kb clonato in un plasmide.
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17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE
Figura 17.8 Mappe dei siti di restrizione
identificati nella regione codificante di un gene
con informazioni relative agli enzimi di
restrizione e alla dimensione dei frammenti di
restrizione (A) oppure alla posizione e alla
composizione delle sequenze di restrizione (B).
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17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH)
Figura 17.9 Procedura di Southern Blot
Hybridization.
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17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH)
Figura 17.10 Risultati di una analisi
elettroforetica di sei campioni di DNA
genomico di Medicago sativa integri e
digeriti con tre diversi enzimi di
restrizione (HindIII, BamHI e EcoRI) (A) e
ibridati con una sonda specifica per una
ß-tubulina (B).
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17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Figura 17.11 Schema di PCR ogni ciclo prevede la
denaturazione del DNA stampo, libridazione dei
primer e la polimerizzazione dei nuovi filamenti.
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17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Figura 17.12 Numero delle molecole di DNA
sintetizzate in relazione al numero di cicli di
PCR (A) rappresentazione schematica
dellamplificazione di una molecola di DNA (B) e
grafico che mostra lincremento della quantità di
DNA (C).
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17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Tabella 17.3 Relazione tra efficienza (E) di PCR
e numero di copie.
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17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Figura 17.13 Risultato dellanalisi
elettroforetica di prodotti di amplificazione orig
inati mediante PCR con primer specifici per un
determinato gene (M marcatori di peso
molecolare).
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17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Tabella 17.4 Nomenclatura usata per le
degenerazioni.
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17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.14 Procedura per lanalisi di marcatori
RFLP.
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17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.15 (A) Natura del polimorfismo
RFLP (B) natura del polimorfismo VNTR.
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17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.16 Esempi di profili RFLP Ottenuti con
sonde singolo-locus in una popolazione segregante
(A, B) e con sonda multi-locus (C).
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17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.17 Esempi di polimorfismi VNTR dovuti
alla successione di un numero variabile di
elementi ripetuti compresi tra due siti di
restrizione.
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17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
METODI DI MARCATURA DI SONDE E PRIMER
Figura 17.18 Marcatura radioattiva del DNA
mediante nick translation (A), random priming
(B) e procedura di DIG labeling (C).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
Figura 17.19 Analisi di marcatori RAPD con primer
decamerici (10-mer) casuali.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
Figura 17.20 Rappresentazione schematica della
natura del polimorfismo multi-locus dei marcatori
RAPD (o AP-PCR).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
Figura 17.21 Esempi di profili RAPD A) landrace
di radicchio (primer OPA1) B) popolazione
segregante di mais (primer OP-B20) C) linea
inbred di mais (primer OP-C7) D) landrace di
radicchio (primer M13).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Tabella 17.5 Elenco di SSR analizzati nelle
piante.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.22 Confronto tra regioni di 50
kb appartenenti ai genomi di mais, uomo, lievito
e E. coli (modificata da T.A. Brown 1999).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Tabella 17.6 Frequenza e distribuzione di
microsatelliti nei genomi di alcune piante.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.23 Analisi dei marcatori microsatelliti
(SSR).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.24 Strategia per il clonaggio di SSR
mediante costruzione e screening di una libreria
genomica.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.25 Strategia per il clonaggio di SSR
mediante amplificazione di frammenti di
restrizione con primer Inter-SSR in combinazione
con primer AFLP.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.26 (A) Natura del polimorfismo SSR i
modelli di bande al locus microsatellite sono
diversi a seconda della situazione allelica
lindividuo eterozigote a/b mostra due
bande mentre quelli omozigoti a/a e b/b
soltanto una. (B) Natura del polimorfismo Inter-SS
R con primer ancorati in 5' oppure in 3'.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.27 Esempi di profili SSR in 15 cultivar
di vite (A) originatesi per ibridazione tra Pinot
nero (P) e Gouais bianco (G) e in oltre 60 piante
appartenenti ad una popolazione locale di mais
(Marano) (B). Esempi di profili SSR radioattivi e
fluoresceinati (C, D). Rilevazioni di alleli
microsatelliti in genotipi omozigoti ed
eterozigoti mediante analisi di frammenti con
sequenziatore (E).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI I-SSR
Figura 17.28 Analisi di marcatori Inter-SSR
(Nbasi selettive).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI I-SSR
Figura 17.29 Esempi di profili elettroforetici
prodotti da marcatori Inter-SSR in popolazioni
locali di mais (A) e radicchio (B).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
Figura 17.30 Procedura per la rilevazione di
marcatori AFLP comprendente la digestione del DNA
con due distinti enzimi di restrizione, la
ligazione di adattatori, la pre-amplificazione
e lamplificazione finale con primer aventi una o
più basi selettive.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
Figura 17.31 Marcatori AFLP fluoresceinati polimo
rfismi genomici ottenuti usando diverse
combinazioni di enzimi di restrizione/primer con
due o più basi selettive ciascuno (foto S.
Ancillotti).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
Figura 17.32 Marcatori AFLP radioattivi (A)
prova di primer condotta con combinazioni Eco/Mse
aventi tre basi selettive usando DNA genomico di
poa pratense (P) ed erba medica (M) (B) alleli
marcatori AFLP segreganti in una popolazione
sperimentale di mais.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI M-SAP
Figura 17.33 Tecnica M-SAP attività degli enzimi
HpaII e MspI in relazione alla metilazione di
entrambi oppure di uno soltanto dei filamenti.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SAMPL e M-AFLP
Figura 17.34 Analisi di marcatori SAMPL (A), di
marcatori M-AFLP (B) e di marcatori S-SAP (C).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SAMPL e M-AFLP
Figura 17.35 Esempi di profili SAMPL (A) generati
in una popolazione segregante di Medicago sativa
con la combinazione di primer As1/MseAAC e di
Microsatelliti-AFLP in Poa pratensis ottenuti
usando le combinazioni di primer
EcoCCA/CGCAA(CA)9 (B) e EcoCAC/GCCAC(GCT)6 (C)
esempi di profili S-SAP (D) generati in una
popolazione segregante di Medicago sativa con il
primer LTR-derivato Ret1 (5'-CGGTTTTGTGGGGTTGTGTTA
GGCCA-3') in combinazione con il primer MseATC
(foto E. Albertini).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI S-SAP
Figura 17.36 Esempi di profili TRAP i prodotti
di amplificazione sono stati ottenuti usando un
primer AFLP (Eco1 oppure Pst1) in combinazione
con un primer degenerato disegnato in una regione
conservata (dominio) di famiglie multigeniche
(CDK, cicline, fattori delle auxine, MADS box,
tubuline, LRR) (foto G. Galla).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI STS
Figura 17.37 Procedura per lo sviluppo di
marcatori SCAR e CAPS. Esempi di profili
elettroforetici generati da marcatori SCAR e CAPS.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI STS
Figura 17.38 Tecnica di PCR inversa (inverse PCR).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
INDICI INFORMATIVI DI POLIMORFISMO
Tabella 17.7 Valori di MI e AI in erba medica
(Medicago spp.), soia (Glycine max) e mais (Zea
mays).
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.39 Concetto di SNP allineamento
multiplo di sequenze che mostrano
polimorfismo dovuto a singoli nucleotidi.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.40 Rappresentazione grafica di un
aplotipo molecolare basato su marcatori SNP.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Tabella 17.8 Ripetizioni mononucleotidiche del
genoma cloroplastico di alcune specie vegetali.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.41 Analisi SNP del genoma
cloroplastico (A) esempi di polimorfismi
visualizzati mediante elettroforesi (B)
allineamento di sequenze con polimorfismi a
carico di motivi mononucleotidici.
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17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI
AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Tabella 17.9 Lista delle combinazioni di primer
ccmp1-10 utili per studiare il polimorfismo di
sequenze ripetute semplici nel genoma
cloroplastico delle angiosperme.
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17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
Figura 17.42 Tecnica FISH schema di ibridazione
e rilevazione del segnale sui cromosomi (A) FISH
multicolore (B).
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17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
Tabella 17.10 Capacità di risoluzione della
tecnica FISH in ibridazioni con cromosomi
metafasici, pachitenici e con fibre distese.
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17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
Figura 17.43 Cariogramma di Medicago truncatula
che mostra la distribuzione di eucromatina e
eterocromatina dei cromosomi del corredo di
base usando le informazioni acquisite mediante
analisi FISH usando sonde isolate da una libreria
genomica (modificata da O. Kulikova et al. 2001,
Plant Journal).
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17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.44 DNA genomico integro (G) e sonicato
(S). Mmarcatori di peso molecolare (foto S.
Meneghetti).
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17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.45 Ibridazione genomica in Brassica
juncea usando B. campestris e B. nigra (fonte J.
Malaszynska et al. 2003, Intl. Polyploidy Conf.).
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17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.46 Preparati di cromosomi
pro-metafasici di salice bianco (A), salice
fragile (C) e di un loro ibrido (B). Risultati di
esperimenti di ibridazione in situ genomica
(GISH) tra S. alba e S. fragilis (D, E), tra S.
alba e ibrido (F, G), tra S. fragilis e S. alba
(H, I) e tra S. fragilis e ibrido (J, K) (foto
S. Meneghetti e Hans de Jong).