PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Cuantificaci

1
PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de
Proteínas
2
Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and
M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem.
177 751-766, 1949

• El método de Biuret se basa en la reacción de
  sales de Cu2 con moléculas que contienen más de
  dos enlaces peptídicos en un medio alcalino el
  cobre es reducido a Cu formando complejos color
  púrpura que tienen un máximo de absorción a 540
  nm. El método se usa para soluciones que tienen
  de 0.5 a 10 mg proteína/ml.
• Es un método poco sensible. Es útil cuando se
  quiere analizar grandes lotes de proteína.
• Existen compuestos que interfieren con la
  lectura, tales como tioles y sales de amonio, que
  pueden removerse precipitando la proteína con un
  volumen igual de ácido tricloroacético al 10,
  resuspendiendo el precipitado que contiene las
  proteínas en NaOH 1 N.

3
Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr,
and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193 265. 1951

• El color producido por el método de Lowry resulta
  de la reacción de Biuret sobre los enlaces
  peptídicos, además de la reducción del reactivo
  de fosfomolibdato-fosfotungstato
  (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas
  con cobre en medio alcalino.
• El Cu y los grupos R de la tirosina, triptofano
  y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin,
  produciendo un producto inestable que es reducido
  a azul de molibdeno/tungsteno.
• El color azul, es determinado a 650 nm.
• Este es un método muy sensible, por lo que
  permite trabajar con soluciones muy diluídas de
  proteínas (0.02 - 0.5 mg proteína/ml).

4
Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal.
Biochem. 72, 248

• El método de Bradford de basa en que el Azul
  Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a
  azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina
  en las proteínas.
• El complejo proteína-colorante tiene un
  coeficiente de extinción elevado, lo que le
  confiere gran sensibilidad.
• La reacción entre el colorante y la proteína es
  muy rápida (aproximadamente 2 min), y el completo
  proteína-colorante permanece disperso en solución
  por un tiempo relativamente largo.
• Rango de detección 0.5-10 mg proteína/ml.

5
Absorción Ultravioleta de las Proteínas

• La mayoría de proteínas presenta un máximo de
  absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de
  aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y
  fenilalanina).
• La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir
  proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5
  mg/ml, en la ausencia de sustancias que
  interfieran con la lectura.
• Algunas preparaciones de proteínas parcialmente
  purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los
  cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm.
• Una ecuación para calcular la concentración de
  proteína en la presencia de ácidos nucleicos en
  cubetas de 1 cm de paso es
• (proteína)mg/ml 1.55 A280nm - 0.76 A260nm
• La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260
  1.75) en la presencia de ácido nucleico de
  levadura (A280/A260 0.49) y por tanto puede no
  ser precisa para otras proteínas y otros ácidos
  nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una
  solución de proteína 0.1 (p/v) varía entre 0.5 y
  2.5, dependiendo de la proporción de aminoácidos
  aromáticos que contengan.

6
Absorción Ultravioleta de las Proteínas

• Todas las proteínas absorben fuertemente debajo
  de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina
  (0.1 p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215,
  respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La
  absorbancia por debajo de 230 nm es debido al
  enlace peptídico.
• Consecuentemente los valores de A 0.1 son casi
  los mismos para todas las proteínas.
  Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a
  100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de
  absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva
  standard graficando A vs. proteínas.
• (proteína)ug/ml 144 (Acm215 - Acm225)
• La diferencia de absorbancia es usada para
  minimizar errores que resulten de compuestos no
  proteicos en solución. Altas concentraciones de
  ciertos buffers pueden interferir (no se puede
  usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5
  mM NaOH no causa problemas).