Ana Denicola

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INTERACCIONES MACROMOLECULA - LIGANDO

• Ana Denicola
• Curso Fisicoquímica Biológica

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Muchas funciones biológicas involucran la
interacción de pequeñas moléculas (metabolitos,
reguladores, señales) que llamamos ligandos, con
superficies específicas de macromoléculas como
las proteínas que participan en distintos
procesos celulares. Esta interacción implica la
formación de enlaces no-covalentes entre la
pequeña molécula o ión (ligando) con una región
específica de la macromolécula (proteína) que
llamamos sitio de unión. La unión de un ligando a
una proteína puede ser tan fuerte que parezca
irreversible, pero si no se forman enlaces
covalentes, lo podemos considerar un proceso en
equilibrio.
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Proteína P Ligando A P A
PA K PA/ PA K constante de
equilibrio de asociación K constante de
equilibrio de disociación 1/K PA
concentración del complejo proteína-ligando P
concentración de proteína (no acomplejada) A
concentración de ligando libre
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P A PA De esta interacción nos
interesa estudiar - estequiometría, número de
sitios de unión que tiene la proteína para este
ligando A - afinidad, con qué fuerza se une A a
P, comparar con la fuerza de unión de otro
ligando B a la misma proteína -cinética de la
interacción - cambios estructurales que ocurren
en la proteína luego de la unión de A, que pueden
o no llevar a cambios en la funcionalidad de la
proteína - información estructural sobre el
sitio de unión de A a P, fuerzas que intervienen
en la unión
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Sólo un sitio de unión Parámetro experimental
r r moles de ligando unido por mol de
proteína r Aunido/ Ptotal Aunido
PA r PA/ P PA Ptotal P
PA K PA/ PA r K A/ 1K A
un sitio de unión, n1 con afinidad
K (M-1) cte. asociación
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15.6
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Proteína P Ligando A P A
PA K PA/ PA K constante de
equilibrio de asociación K constante de
equilibrio de disociación 1/K PA
concentración del complejo proteína-ligando P
concentración de proteína (no acomplejada) A
concentración de ligando libre
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Múltiples sitios de unión r moles de ligando
unido por mol de proteína r Aunido/
Ptotal Aunido PA 2PA2 3PA3
... Aunido iPAi Ptotal
PAi Ki PAi/ PAi cte. asociación
de cada ligando i con P
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Múltiples sitios de unión Si los sitios de
unión son idénticos e independientes K1 K2
K3 .... K r n K A/ 1 K
A n sitios de unión todos con
afinidad K (M-1)
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15.9 b 15.10 a
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Para evaluar los parámetros n y K, se linealiza
la hipérbola Doble recíproco 1 / r 1 / n
1 / n K A Scatchard r / A n K - r
K n sitios de unión todos con
afinidad K (M-1)
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Doble recíproco
Scatchard
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J. BIOL. CHEM. 265, 12623-12628, 1990 The Human
a2-Macroglobulin Receptor Contains High Affinity
Calcium Binding Sites Important for Receptor
Conformation and Ligand Recognition
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Múltiples sitios de unión no equivalentes
gráfico de Scatchard no da lineal gráfico de
Hill log (r / n - r) log K nH
log A Log (Y/1-Y) log K n log A si
la curva tiene pendiente gt1 para alguna
A cooperatividad positiva si la curva
tiene pendiente lt1 para alguna A cooperativid
ad negativa las proteínas que presentan
cooperatividad de unión en general son
multiméricas (varias subunidades) o monoméricas
con dominios definidos
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15.13
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Métodos experimentales para obtener datos de
unión de ligandos a proteínas 1) Medir la
fracción de ligando unido, r El complejo
proteína-ligando se separa del ligando libre
diálisis en equilibrio (es la técnica más exacta
pero muchas veces demora en alcanzarse el
equilibrio y se requiere cantidades apreciables
de muestra) filtración por membrana,
centrifugación o ultrafiltración cromatografía
de gel filtración sedimentación
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(No Transcript)
20
(No Transcript)
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Métodos experimentales para obtener datos de
unión de ligandos a proteínas 2) Medir la
fracción de sitios de unión ocupados, O O r /
n fracción de saturación se debe seguir un
cambio ( X) ya sea en al proteína o en el
ligando luego de la unión X / X total
O se grafica X en función de A si
se conoce n (número total de sitios) se puede
calcular r y de ahí el tratamiento es igual que
para diálisis en equilibrio
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15.5
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Métodos experimentales para obtener datos de
unión de ligandos a proteínas 2) Medir la
fracción de sitios de unión ocupados, O se debe
seguir un cambio ( X) ya sea en al proteína o
en el ligando luego de la unión X / X total
O
fluorescencia resonancia Raman absorción
UV-vis infrarrojo dicroismo circular
sedimentación NMR EPR electroforesis
capilar difracción RX susceptibilidad a
hidrólisis (por proteasas) susceptibilidad a
oxidación (por peroxidasas) surface plasmon
resonance (Biacore)
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Biochemistry 1988, 27, 1075-1080
1075 Spectroscopic and Thermodynamic Studies on
the Binding of Gadolinium( 111) to Human Serum
Transferrin
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FIGURE 2 (A) EPR titration of 3.6 X lo4 M
apotransferrin in 0.05 M Hepes, pH 7.4, with
Gd(II1). The ratio of Gd to transferrin is given
by the number at the beginning of each spectrum.
Arrows mark g 4.1. Microwave frequency, 9.298
GHz microwave power, 10 mW modulation
frequency, 100 kHz modulation amplitude, 10 G
sweep time, 200 s time constant, 0.5 s sample
temperature, 77 K. (B) Plot of the amplitude of
the g 4.1 signal (1650 G) vs the
Gdtransferrin ratio.
Biochemistry 1988, 27, 1075-1080 1075
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Las proteínas más utilizadas para ensayar esta
interacción son las proteínas séricas albúmina
(humana o bovina) transferrina (o
apotransferrina) IgG Las proteínas séricas (y
en particular la seroalbúmina, la más
concentrada) son el principal blanco si el
metalo-fármaco es administrado i/v, e influye en
su biodisponibilidad
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HSA 585 aa 35C (17 disulfuros C34),
W214 Dominios I, II, III
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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7,8-dihidroxicumarina (Dafnetina) Antioxidante,
quelante, inhibidor de proteina kinasa
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Studies on the interactions between human serum
albumin and imidazolium trans-tetrachlorobis(imid
azol)ruthenate(III) J. Inorg. Biochem. 73 (1999)
123-128
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J Inorg Biochem 73 (1999) 123-
37
J Inorg Biochem 73 (1999) 123-
38
Solution studies of the antitumor complex
dichloro 1,2-propylendi-aminetetraacetate
ruthenium (III) and of its interactions with
proteins. J. Inorg. Biochem. 71 (1998) 45-51.
? Complejo transferrina
? Complejo apotransferrina
? Complejo albúmina
? Complejo libre