Pr

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• Chapitre 8 Structures tridimensionnelles des
  protéines

2. Les protéines fibreuses A. La kératine ? - Une
hélice d'hélices B. Le collagène - Un câble à
trois hélices 3. Les protéines globulaires A.
Interprétation des structures des protéines par
rayons X et par RMN B. Structure tertiaire C.
Bioinformatique structurale
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2 LES PROTEINES FIBREUSES
Les protéines fibreuses sont des molécules
insolubles, très allongées dont les structures
secondaires sont les motifs structuraux
dominants Beaucoup de protéines fibreuses, comme
celles de la peau, des tendons et des os servent
de matériel structural jouant un rôle de
protection, de connexion ou de soutien D'autres,
les protéines musculaires et ciliaires, ont des
fonctions motrices, par exemple la myosine des
muscles squelettiques, muscles lisses et muscles
cardiaques
3
A. La kératine ??- une hélice d'hélices On
distingue les kératines ?, que l'on trouve chez
les mammifères, et les kératines ? chez les
oiseaux et les reptiles. Les kératines (gt 30
gènes chez les mammifères) appartiennent à des
familles de protéines relativement acides (Types
I) ou relativement basiques (Type II)
Protéine fibreuse kératine ? (cheveux, ongles,
cornes) Sous-unités hélices ? presque de bout
en bout ( 310 acides aminés) Dimères 2
sous-unités enroulées en super-hélice de pas
gauche Protofilaments Microfibrille Macrofibril
le Liaisons disulfure à linterface des
protofilaments et microfibrilles
(rigidité) Maladies héréditaires - par exemple
anomalies de séquence dans la kératine 14 ou dans
la kératine 5 qui altèrent l'intégrité de la peau
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Dimère ? protofilament ? microfibrille ?
macrofibrille ? cheveu
5
Vue vers le bas dans l'axe de la spire montrant
l'interaction entre les bords non polaires des
hélices ?. Les hélices présentent une séquence
heptamérique pseudo-répétitive dans laquelle les
résidus a et d sont non polaires
Vue latérale - noter l'emboîtement des chaînes
latérales non polaires en contact (sphères en
rouge) dans le modèle compact
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B. Le collagène- un cable à trois hélices On
trouve du collagène chez tous les animaux
pluricellulaires. C'est une protéine
extracellulaire organisée en fibres insolubles
très résistantes à la tension De nombreux types
différents (une vingtaine) Présentes dans les os,
le tissu conjonctif, les membranes basales, les
dents, les cartilages, les tendons, les
ligaments, les matrices fibreuses de la peau et
des vaisseaux sanguins
I peau, os tendon, cornée, vaisseaux
sanguins 2 sous-unités ? 1 (type I) 1
sous-unité ? 2 (type I) II cartilage, disques
intervertébraux 3 sous-unités ? 1 (type
II) III vaisseaux sanguins, peau fétale 3
sous-unités ? 1 (type III)
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a. Le collagène a une structure en triple hélice
Molécule de collagène Bâtonnet de 300 nm x
1,5 nm Trois chaînes "chaînes ?" ? hélice ?
- hélices à pas gauche - 3 résidus par tour de
spire - pas 0,94 nm incrément 0,31 nm -
comportant un motif répétitif Gly-X-Y X
souvent Pro Y souvent Pro ou 4- ou
3-hydroxyproline ou 5-hydroxylysine Torsadées
en une "superhélice" à pas droit trois chaînes
décalées d1/3 tour de spire Gly occupant le
centre liaisons hydrogène entre chaînes Aux
extrémités éléments non hélicoïdaux intervenant
pour guider lassemblage
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Le collagène a une composition en acides aminés
particulière. Près d'un tiers des résidus sont
des Gly en outre entre 15 et 30 des résidus
sont Pro et Hyp (4-hydroxyproline). On trouve
également la 3-hydroxyproline et la
5-hydroxylysine (Hyl).
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Les résidus hydroxylés sont sont formés après la
synthèse du collagène quand certains résidus Pro
sont transformés en Hyp par la prolyl
hydroxylase. L'Hyp stabilise le collagène par
intermédiare de liaisons hydrogène
intramoléculaires. Dans des conditions qui
inactivent la prolyl hydroxylase, le collagène
est dénaturé à 24C, alors que le collagène
normal est dénaturé à 39C pour former la
gélatine. La prolyl hydroxylase nécessite de
l'acide ascorbique (vitamine C)
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Dans le scorbut, maladie due à une déficience en
vitamine C, le collagène ne peut former des
fibres correctement ce qui entraîne des lésions
de la peau, une fragilité des vaisseaux sanguins,
et des cicatrisations laborieuses a. Le
collagène a une structure en triple hélice La
séquence est une répétition de triplets Gly-X-Y
sur une longueur de 1011 résidus sur 1042
résidus. X est souvent Pro et Y est souvent Hyp.
Le contenu élevé en Gly, Pro et Hyp suggère que
la conformation du squelette polypeptidique est
analogue à celles des hélices de pas gauche de la
polyGly et de la polyPro
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Dans la structure, chaque 3ème résidu de chaque
chaîne polypeptidique passe au centre de la
triple hélice, qui se trouve si encombré que
seule la Gly peut occuper cette position
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Le N-H de chaque Gly établit une liaison
hydrogène forte avec l'oxygène du carbonyl de
d'un résidu X (pro) d'une chaîne voisine. Ces
liaisons hydrogène intercaténaires contribuent à
la stabilisation de la structure
b. Le collagène est organisé en
fibrilles L'aspect strié en microscopie
électronique provient de l'arrangement décalé des
molécules de collagène
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Modifications post-traductionnelles du collagène

• Hydroxylation
• de résidus proline en 3 et 4 hydroxyprolines
  (prolyl hydroxylase)
• de résidus lysine en 5 hydroxylysine
• stabilisent le collagène
• réactions se déroulant dans le réticulum
  endoplasmique
• dépendantes de la vitamine C
• Déficience en vitamine C scorbutisme
• Fragilité capillaire, gingivite, hémorragies
  sous-périostées

• Conversion de lysine en allysine et pontage entre
  molécules
• Glycosylation de résidus hydroxylysine (glucose,
  galactose)

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c. Les fibrilles de collagène sont réticulées par
liaisons covalentes La lysyl oxydase transforme
les résidus Lys en allysine. Deux aldéhydes
subissent une condensation aldolique pour donner
l'aldol allysine. Ce produit peut réagir avec
l'His d'une autre chaîne polypeptidique pour
donner l'aldol His qui à son tour peut régir avec
la 5-OHLys d'une autre chaîne et ainsi, par
réactions croisées, réunir 4 chaîne latérales
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Collagène
Stabilisation - abondance de Pro et de
Hydroxyproline (polyproline forme spontanément
hélice de pas gauche avec incrément de 0,31 nm
et pas de 0,94 nm) - pont hydrogène (entre gly
et pro ou hydroxyproline) - pontage
intermoléculaire - glycosylation d. Des
anomalies du collagène sont à l'origine de
plusieurs maladies chez l'homme - ostéogenèse
imparfaite (mutations dans une des chaînes du
collagène de type I ou de type III). Par exemple,
le remplacement de la Gly centrale par Ala
entraîne une distortion de la triple hélice et
diminue sa température de dénaturation de 62C à
29C
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3 LES PROTEINES GLOBULAIRES
Les protéines globulaires comprennent par exemple
les enzymes, les protéines de transport et les
récepteurs. Les relations structure-fonction des
protéines globulaires sont le résultat des
déterminations de structure par rayons X et par
résonance magnétique nucléaire (RMN)
A. Interprétation des structures des protéines
par rayons X et par RMN La cristallographie par
rayons X donne directement l'image des molécules.
Un cristal de la protéine est exposé à un
faisceau de rayons X et le spectre de diffraction
est enregistre par un compteur de radiations. Les
rayons X sont générés par des synchrotrons
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a. La plupart des structures cristallographiques
n'atteignent pas la résolution atomique Les
cristaux de protéines sont fortement hydratés
(40-60 d'eau en volume). Les molécules de
protéine se présentent dans un désordre de plus
d'un angström. On dit que le cristal a une limite
de résolution de cette taille. Les cristaux
protéiques ont des limites de résolution
comprises entre 1,5 et 3Å
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Les rayons X interagissent presqu'exclusivement
avec des électrons, pas avec les noyaux. Une
structure par rayons X est donc l'image de la
densité électronique. Les analyses structurales
modernes se font par ordinateur où les cartes de
densité électronique d'une suite de sections
parallèles apparaissent en trois dimensions
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Coupe à travers la carte de densité électronique
de résolution de 2Å de myoglobine de cachalot,
qui contient un noyau hème. La densité
électronique est représenté par de courbes de
densité tout comme l'altitude est représenté sur
une carte topographique. Le pic au centre de la
carte représente l'atome de Fe dense en
électrons La possibilité d'obtenir des cristaux
de résolution suffisante est le facteur limitant
de détermination de structure tridimensionnelle
par cet analyse
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La qualité d'une carte de densité électronique
varie selon sa limite de résolution. Pour une
résolution de 1,1 Å, les atomes (sauf hydrogène)
sont tout à fait visibles
La structure primaire de la protéine doit être
connue - permet de faire coïncider la séquence
et sa carte de densité électronique
b. La plupart des protéines sous forme de cristal
gardent leurs conformations natives Les protéines
à l'état de cristal présentent pratiquement les
mêmes structures que celles en solution
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1. Une protéine à l'état de cristal baigne dans
le solvant de cristallisation sur toute sa
surface
2. Lorsque la structure d'une protéine a été
déterminée à l'état de cristal, par rayons X, et
en solution, par RMN, les deux structures sont
essentiellement les mêmes
3. De nombreuses enzymes, une fois cristallisées,
sont toujours catalytiquement actives. Les
enzymes cristallisées actives doivent par
conséquent avoir des conformations très proches
de celles en solution
c. Détermination de la structure des protéines
par RMN La détermination des structures
tridimensionnelles de petites protéines
globulaires en solution aqueuse est possible
grâce à la spectroscopie par RMN à deux
dimensions (2D). Ces techniques fournissent les
distances interatomiques de protons distants de lt
5 Å dans une protéine de séquence connue. Les
mesures de des distances entre protons n'étant
pas très précises, ne permettent pas d'en déduire
une structure unique. La structure d'une protéine
obtenue par RMN est souvent un ensemble de
structures compatibles avec les contraintes
géométriques
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Spectroscopie nucléaire par effet Overhauser
(NOESY) d'une protéine donnant des courbes de
niveau le long des deux axes de fréquence ?1 et
?2. Les lettres a à d donnent la position de 4
protons représentés par des petits cercles. Les
flèches en pointillés indiquent les pics
correspondants sur la diagonale de RMN. Les pics
de croisement i, j et k situés aux intersections
des lignes horizontale et verticale à travers
deux pics de la diagonale, indiquent qu'il y a un
NOE entre les deux protons correspondants et
qu'ils sont distants de lt 5 Å
Structure par RMN du domaine SH3 de la protéine
Src (64 résidus)
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1. Les méthodes actuelles de RMN ne permettent
pas de déterminer la structure d'une protéine gt
40 k Da
2. Les techniques par RMN permettent de
déterminer les structures de protéines qui ne
cristallisent pas
3. L'RMN peut suivre des mouvements dans l'étude
du repliement et de la dynamique des protéines
d. Les structures moléculaires des protéines sont
simplifiées Les quelques centaines d'atomes
autre que l'hydrogène d'une protéine rendent la
compréhension de sa structure détaillée très
difficile Une façon de représenter la squelette
peptidique est de se limiter à des atomes C?
(squelette des C?)
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
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Représentation de la structure par rayons X de la
myoglobine de cachalot
Protéine constituée que d'hélices ??séparées par
courts segments de liaison de conformation
enroulée
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1-100 101-200 201-300 301-400 401-463
Représentation de la structure par rayons X de
l'hexokinase
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1-100 101-200 201-300 301-400 401-463
29
Glu, Asp Lys,Arg
30
Tyr Phe Trp
31
Résidus liant le glucose
32
(No Transcript)
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B. Structure tertiaire La structure tertiaire
d'une protéine est le repliement de ses éléments
à structure secondaire
Représentation de la structure par rayons X de la
concanavaline A du haricot sabre Les flèches
dirigées vers l'extrémité C-terminale indiquent
le feuillet ? plissé antiparallèle
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a. Les protéines globulaires peuvent présenter à
la fois des hélices ? et des feuillets ?
La plupart des protéines ont des quantités
significatives des deux types de structure
secondaire (en moyenne, environ 31 d'hélice ? et
28 de feuillet ? le reste en tournants et
boucles ??
Représentation de la structure par rayons X de la
carbonic anhydrase humaine
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b. La disposition des chaînes latérales varie
avec leur polarité
Hélice amphipathique hélice H de la myoglobine

• Les résidus non polaires Val, Leu, Ile, Met, Phe
  se trouvent à l'intérieur de la protéine, à
  l'abri de l'eau par interactions hydrophobes
• Les résidus polaires chargés Arg, Lys, His, Asp
  et Glu sont situés à la surface en contact avec
  l'eau
• 3. Les groupements polaires non chargés Ser, Thr,
  Asn, Gln, Tyr et Trp sont habituellement à la
  surface. A l'intérieur, ces résidus établissent
  des liaisons hydrogène avec des groupements
  accepteurs enfouis

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Hélice amphipathique hélice H de la myoglobine
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L'intérieur d'une protéine se rapproche d'un
cristal moléculaire plutôt qu'une goutte d'huile
il est efficacement rempli. Les chaînes latérales
hydrophobes au coeur de la protéine prennent des
conformations relâchées avec des angles de
torsion décalés de faible énergie
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c. Les protéines de grande taille forment des
domaines Les chaînes polypeptidiques de plus de
200 résidus se replient généralement en deux
blocs qu'on appelle des domaines qui confèrent à
ces protéines une forme bi-lobée Dans la
glycéraldehyde déshydrogenase ici à droite, le
NAD se lie au domaine inférieur (en rouge)
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d. Les protéines sont faites de structures
supersecondaires En se
combinant, des groupes de motifs supersecondiares
peuvent former la structure tertiaire d'un
domaine appellé "pli" ("fold")
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C. Bioinformatique structurale Les coordonnées
atomiques des structures des protéines sont
reprises dans la Banque de Données des Protéines
("Protein Data Bank" PDB http//www.rcsb.org/pdb/
Les structures peuvent être examinées en
utilisant un programme de graphisme moléculaire,
par exemple RasMol http//www.umass.edu/microbio/
rasmol/index.htm On peut superposer la séquence
d'une protéine d'intérêt sur une structure connue
à partir d'un alignement de structure primaire en
utilisant le programme de graphisme moléculaire
Cn3D http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/
cn3d.shtml
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http//ncbi.nih.gov/Structure/CN3D/cn3dtut.shtml