CAT opsporen van parasieten in faeces: wat en voor wie?

1
CATopsporen van parasieten in faeces wat en
voor wie?

• Kristien Van Vaerenbergh
• 21 januari 2005
• Supervisor Prof. Dr. K. Lagrou
• Search verified by Dr. J. Frans

2
Parasieten in faeces

• Voor wie is deze analyse van toepassing?
• Optimale voorwaarden voor parasieten onderzoek in
  faeces
• Beschikbare methoden
• Wat kan er concreet aangeboden worden?
• -2004
• -toekomst

3
IDSA richtlijnen Management of Infectious
Diarrhea (2001)

• Steeds breder wordend arsenaal van pathogenen met
  toegenomen diagnostische mogelijkheden
• Evaluatie en management van infectieuse diarree
  moet kosten-efficiënt zijn

4
IDSA richtlijnen Management of Infectious
Diarrhea (2001)
5
Voor wie van toepassing?
6
Voor wie van toepassing?

• Selectieve aanpak van diarree
• Community-acquired diarree
• Reizigersdiarree
• Hospital-acquired diarree
• Persisterende diarree (gt 7 dagen)
• zeker indien immuungecompromitteerd

7
Voor wie van toepassing?

• De meeste episodes van acute community-acquired
  diarree viraal / zelflimiterend / van korte duur
  microbiologisch onderzoek binnen de 24 uur na
  aanvang zelden van toepassing

8
Voor wie van toepassing?

• Reizigersdiarree risico is sterk afhankelijk
  van reisbestemming
• Meestal acuut probleem, vaak bacterieel

Acute diarree lt2 weken verwekkers
Viraal Calicivirussen (Norwalk), rotavirus, enterovirus 5 tot 10
Bacterieel enterotoxigene E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella species, Salmonella species, Vibrio, Aeromonas, Pleisiomonas, Clostridium difficile 50 tot 75
Parasitair Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica, Cyclospora cayetensis, Isospora belli tot 5
9
Voor wie van toepassing?

• Chronische reizigersdiarree langer dan twee
  weken bij 10 van de reizigers parasieten wel
  belangrijk

Chronische diarree verwekkers
Bacterieel cfr supra ook Yersinia zz
Fungi Histoplama capsulatum zz (respiratoire S)
Parasitair Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Entamoeba histolytica Cyclospora cayetensis Isospora belli Microsporidium tot 30 waterige diarree bloederige d, T waterige d, T eosinofilie immuundeficiëntie
10
Voor wie van toepassing?

• acute community-acquired diarree en acute
  reizigersdiarree
• - indien faeces onderzoek faeces cultuur, evt
  EHEC
• - C. difficile kan van toepassing
  zijn

11
Nosocomiale diarree

• Tijdens de eerste 3 dagen van hospitalisatie
  community-acquired diarrhea
• Vaak niet-infectieus tgv medicatie, parenterale
  voeding
• Ontstaan na de eerste 3 dagen van hospitalisatie
  C. difficile uitsluiten
• Parasieten onderzoek en klassieke faeces cultuur
  uitermate lage opbrengst bij patiënten die
  diarree ontwikkelen na de eerste 3
  hospitalisatiedagen, ook in pediatrische
  populaties
• Kan wel bij verdere investigatie van
  community-acquired diarree

12
Persisterende diarree

• Uitsluiten van parasieten, zeker indien
  immuungecompromitteerd
• Giardia
• Cryptosporidium
• Entamoeba histolytica
• Cyclospora
• Isospora belli
• Bijkomend bij HIV Microsporidia
• Bijkomend bij TX-kandidaten Strongyloides
  stercoralis uitsluiten

13
Persisterende diarree - HIV

• Vóór de periode van HAART diarree frequente
  complicatie van HIV-infectie chronische diarree
  verantwoordelijk voor 17 nieuwe AIDS-diagnoses
  bij CDC
• Dankzij HAART dramatische afname van incidentie
  van diarree (cfr andere opportunistische
  infecties)
• Conservatieve houding immunologisch
  herstel vaak genezing chronische diarree herval
  bij falen R/
• Diarree bij HIV vaak infectieus van oorzaak
  virulente kiemen bij intacte afweer/
  immuundeficiëntie ook minder virulente kiemen
  bij gevorderde HIV/AIDS

14
Persisterende diarree - HIV
Up to date
15
Persisterende diarree - HIV
Oldfield E., Reviews in gastroenterological
disorders, 2002.
16
Microsporidia

• Opportunistische pathogeen
• HIV belangrijke verwekker van chronische diarree
  bij CD4 lt 100/ul
• Ook bij TX, reizigers, ouderlingen
• Obligate intracellulaire sporenvormer Vooral
  Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon species
  resistente sporen
• Wereldwijd voorkomen

17
Microsporidia

• Transmissie feco-oraal, evt via urine minimum
  aantal sporen nodig?
• S vooral gastro-intestinaal, ook genito-urinair,
  respiratoir, gedissemineerd
• D sporen zeer klein (1-2 um)
• geen effectieve concentratietechnieken
  
• gemodifieerde trichroomkleuring,
  fluorescentie technieken (FungiFluor,
  Calcofluor white)
• gouden standaard electronenmicroscopie
  sensitiviteit van gemod. Trichroom en Calcofluor
  tov EM 100, specificiteit ongeveer 80.
• R/ Immunologisch herstel belangrijk voor
  genezing, naast chronische, antiparasitaire
  therapie (albendazole voor Encephalitozoon
  infecties)

18
Microsporidia

• Spore injecteert infectieuse sporoplasma in
  gastheercel via polaire filament
• multiplicatie via binary/multiple fission
• maturatie van sporen

Spore in faeces zeer klein (1-2 um)
19
Microsporidia

• Chromotroop 2R kleuring
• zwarte pijl E. bieneusi sporen
• gele pijl gevacuoliseerde spore
• rode pijl gist

CDC
20
Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora

• Cryptosporidium parvum
• samen met Giardia belangrijke parasitaire
  darmpathogeen
• klinisch beeld variabel, vooral waterige diarree
  (zelflimiterend indien immuuncompetent, tot
  chronisch bij AIDS)
• vaak jonge kinderen
• feco-oraal via gecontamineerd water of voedsel
• D/ oöcyste 3-4 um gemodif. zuurvaste kleuring/
  auramine/ safranine/ antigendetectie
• R/ immuunreconstitutie

21
Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora

• Cyclospora cayetanensis
• Was vroeger al opgemerkt in faeces blauw-groene
  algen
• wereldwijd voorkomen
• diarree bij reizigers, bij AIDS - patiënten,
  food - borne outbreaks
• Zelflimiterende tot aanslepende diarree AIDS
  cfr Cryptosporidium en Isospora
• D/ gemodifieerde zuurvaste kleuring
• autofluorescentie, safranine
• R/ SXT

Niet gekleurd - M. Lontie
22
Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora

• Cyclospora cayetanensis
• oöcysten 8 tot 10 um
• oöcysten hebben enkele dagen
• nodig na excretie voor ze infectieus zijn
  (ontwikkeling van gesporuleerde oöcysten)

23
Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora

• Isospora belli
• minst frequente van de drie
• wereldwijd voorkomen, outbreaks gerapporteerd
• vooral bij immuungedeprimeerden
• AIDS aanslepende waterige diarree, wasting cfr
  Cryptosporidium
• kinderen ernstige diarree
• R/ immuunreconstitutie SXT

24
Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora
Isospora belli typische, ellipsoïdale oöcyste,
groot (25-30 um)
25
. A, C en E gemodifieerde zuurvaste kleuring .
B, D en G bright field microscopy . E, H UV
flurescentie autofluorescentie (Cryptosporidium
niet)
26
Strongyloides stercoralis

• Moet altijd uitgesloten worden bij Tx-kandidaten,
  indien verblijf in endemische regio in
  voorgeschiedenis
• Endemische regio ZO-Azië, Latijns-Amerika,
  zuidoostelijke staten VS, ook Turkije en
  Noord-Italië
• Chronische infectie - onopvallend
• - GI, pulmonale, cutane S,
  eosinofilie
• - symptomen
  kunnen jaren persisteren
• Diagnose - detectie larven in faeces
  (rechtstreeks, na concentratie) na 3
  stalen sensitiviteit 50
• - Baermann concentratie,
  cultuur zz in routine
• - serologie sensitiviteit
  en specificiteit gt 90
• - microscopische detectie
  en serologie zijn complementair

27
Strongyloides stercoralis rhabditoid larva
(unstained).
M.Lontie
28
Strongyloides stercoralis
29
Strongyloides stercoralis
30
Strongyloides stercoralis

• autoinfectie penetratie van perianale huid of
  colonmucosa door rhabditiforme larven, wat kan
  leiden tot hyperinfectie en gedissemineerde
  ziekte (bacteriëmie, meningitis zeer hoge
  mortaliteit)
• Immuunsuppressie (ook corticosteroiden)
  risicofactor voor hyperinfectie ! Alvorens te
  starten Strongyloides uitsluiten
• ook van belang bij HIV- en HTLV-infectie
• therapie thiabendazole, ivermectin

31
Dientamoeba fragilis

• Behoort tot flagellaten (the unflagellated human
  flagellate ) nog geen cystevorm gekend
• Trofozoiet fragiel, 1 of 2 kernen met 4-6
  granules, 5-15 um
• Wereldwijd voorkomen
• Diagnose fixatie en permanente kleuring, zoniet
  geen detectie van fragiele trofozoiet
  intermittente aanwezigheid vaak miskend
• Transmissie ? Vaak samen aanwezig met Enterobius
  vermicularis
• Pathogeniciteit lang betwijfeld
  incubatieperiode? Proportie asymptomatische
  infecties?

32
Dientamoeba fragilis

• Symptomen abdominale pijn (kan persisteren
  gedurende jaren), diarree, anorexie, moeheid,
  nausea, vermagering regressie van S na therapie
• Infecties bij kinderen frequent -vaak milde
  infecties seroposotiviteit 91 bij gezonde,
  Canadese kinderen (Chan et al, 1996)
• - vaker symptomatisch dan bij
  volwassene
• 
  - eosinofilie
• Therapie Paromomycine, tetracycline,
  metronidazole

33
Dientamoeba fragilis
34
Dientamoeba fragilis

• geen cyste vorm gekend, trofozoiet 1 of 2
  kernen, 5-15 um, polymorf
• fixatie en permanente kleuring
  (ijzer-hematoxiline trichroom)
• DD Endolimax nana, E. hartmanni

35
Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces

• Collectietijden en aantal stalen 3 stalen over
  een perioden van 7 tot 10 dagen owv intermittente
  aanwezigheid en variabele Geen collectie van
  meerdere stalen op dezelfde dag
• Tijdsframe verse preparaten
• voor beweeglijke protozoa
• kans het grootst in vloeibare
• stalen, bekijken binnen het half
• uur na produktie! Zoniet, fixeer-
• middel gebruiken.
• Koelkast vertraagt deterioratie

36
Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces

• Interferende substanties mbt detectie 7 dagen
  wachten na gebruik van AB, barium, antimalaria
  middelen, minerale olie
• Staalcollectie goed sluitende container
  minimaal enkele grammen faeces, om uitdroging te
  voorkomen
• 3-day-rule Faeces cultuur en parasieten
  extreem lage opbrengst, zo diarree ontstaan is na
  3 dagen hospitalisatie, ook bij pediatrische
  populaties. In deze setting C. difficile
  opsporen. Overleg labo-kliniek zeer belangrijk in
  opstellen van rejectiecriteria veilige grens
  van 5 dagen / modified 3-day-rule

37
Beschikbare methoden intestinale parasieten

• Macroscopische inspectie consistentie, bloed,
  slijm
• Microscopisch onderzoek cysten en trofozoieten
  van amoeben, flagellaten en coccidia,
  wormeneieren en larven
• - de grootte (te meten met een micrometer)
• - het aspect van de kern
• - randen
• - RO verse faeces opsporen trofozoieten (lage
  gevoeligheid tijd !)
• - Concentratiemethoden globale methoden
• - flotatie (hoog SG suiker, zinksulfaat)
• - sedimentatie
  (formaline-ether en derivaten laag SG)
• voordelen sedimentatie minder
  technische fouten, eenvoudiger, grootste
  range detecteerbare organismen

38
Soortelijk gewicht

• S.G. of Zn-sulfate 33 1.180
• S.G. of formol-solution 10 1.019
• S.G. of ether 0.714
• S.G. of parasites Ancylostoma 1.055 Giardia
  1.060 Entamoeba histolytica (coli) and Endolimax
  nana 1.065 - 1.070 Ascaris 1.110 Trichuris
  1.150, Chilomastix mesnili 1.180 Ascaris
  (unfertilized) 1.200 (Bailenger, 1965).

M. Lontie
39

• Microscopisch onderzoek
• VS, Nederland faeces in fixeermiddel (SAF,
  formaline, PVA)
• permanente kleuring (trichroom,
  chromotrope kl)
• Pro - geschikt voor trofozoieten en cysten
• - herbekijken, expert advies mogelijk
• Contra - expertise nodig

• EIA, DFA monoclonale antistoffen tegen
  welbepaald species (Giardia, Cryptosporidium,
  Entamoeba histolytica)
• Pro - verhoogde sensitiviteit,
  specificiteit en tijdswinst
• EIA giardiasis
  bijna even gevoelig als microscopie op 2
  opeenvolgende stalen (Mank, 1997)
• Contra -duur
• PCR identificatie van Entamoeba species,
  detectie en identificatie Microsporidia
  Blessmann (2002) E. histolytica real time PCR
  significant gevoeliger dan microscopie, 100
  specifiek

40
Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003.

• 544 patiënten, 85 exacte inlevering
• 72 SAF preparaten enkel met lugol
• conventionele methode 22.9
• TFT 45.2
• Intermittente shedding
• voordeel tgv - betere compliance
• - fixatief
• - permanente kleuring
• acceptabele meerkost

41
Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003.
Tabel van gool
42
Faeces parasieten in de praktijk 2004

• Microbiologisch faeces onderzoek cultuur, C.
  difficile (cultuur en toxine), opsporen van
  parasieten ook virologie
• parasieten faeces - macroscopisch nazicht
• - microscopisch onderzoek na
  Ritchie-concentratie
• -
  auramine/safraninekleuring op vraag of bij MO
  verdacht voor Cryptosporidium
• Kostprijs voor labo faeces parasieten 7.44 euro
• 
  Cryptosporidiumkleuring 8.40 euro
• In 2004 parasieten faeces 1778 uitgevoerd
  dalende trend tov vorige jaren (2327 in 2001 en
  2002, 2111 in 2003)

43

• Aanvragers van faeces parasieten in 2004
• vanaf 8 aanvragen / jaar weerhouden
• Grote aanvragers E409 (29), E302 (9.5) en
  E595 (8).

44

• In 2004 werd 1778 keer parasieten in faeces
  uitgevoerd. Aanvragen per maand variëren tussen
  125 en 183. Hoogste opbrengst in maanden
  april-juli (6.5-8.2).

45

• In 2004 werden 106 parasieten gedetecteerd,
  86/1778 stalen waren positief (4.8). Positieve
  stalen waren afkomstig van 67 patiënten.
• 36 parasieten evt pathogeen (E.
  dispar/histolytica)

Gedetecteerde parasieten in 2004
46

• Omgerekend naar patiënten Giardia lamblia (18),
  Entamoeba histolytica/dispar (6), Taenia (2) en
  Cryptosporidium (1).
• In 2004 werden 1778 parasieten faeces
  uitgevoerd, voor 27 patiënten werd een pathogene
  parasiet gedetecteerd.

Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004
47

• In het MCH in Leuven werd de analyse parasieten
  faeces 4809 keer uitgevoerd in 2004, met een
  positief resultaat in 10.8 van de stalen.
• Frequentst gedetecteerd Blastocystis hominis
  (273), Giardia lamblia (119) en Cryptosporidium
  (40).
• Blastocystis hominis goed voor 46 van tot
  aantal parasieten

Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004
- MCH
48
Blastocystis hominis

• Pathogeniciteit controverse
• Onduidelijkheid over classificatie,
  levenscyclus, transmissie
• Komt wereldwijd voor
• Diagnose cyste - achtige structuur in faeces
  nogal labiel
• grootte sterk var (6 - 40 um)
• vers preparaat
• fixatie en permanente
  kleuring
• Heel frequent (81/ 247 in Nederland, T Mank,
  1997)

49
Blastocystis hominis
Gramkleuring
Lugol Trichroom

• Ronde tot ovale cyste-achtige structuur met
  centrale vacuole, ring van cytoplasma met nuclei
• Grootte sterk variabel

50
Faeces parasieten in de praktijk 2004
positieve aanvragen (86) pos. aanvragen / totaal aanvragen ( pos) ptn met positief resultaat ( /67)
E 409 52 52/497 (10) 36 (53)
E 302 10 10/166 (6) 8 (12)
E 595 7 7/139 (5) 7 (10.5)
51
Patiënten met een positief resultaat hoeveel
stalen beschikbaar ?
52
Faeces parasieten in de praktijk 2004

• Oktober en november samen
• 267 analyses uitgevoerd
• 3.7 analyses positief resultaat
• In 76 maar één staal voor handen
• In 9 van de aanvragen, patiënt langer dan 3
  dagen gehospitaliseerd geen parasieten
  gedetecteerd
• In 31.5 combinatie van faeces cultuur, opzoeken
  C. difficile en parasieten. Bij kinderen ook in
  combinatie met detectie virussen
• parasieten faeces - macroscopisch nazicht
• - microscopisch onderzoek na
  Ritchie-concentratie

53
Faeces parasieten in de toekomst

• Selectief omstandigheden waaronder parasieten
  onderzoek niet optimaal zijn
• Faeces parasieten - wel bij aanslepende diarree
  buiten het ZH (community-acquired, reizigers,
  immuungecompromitteerd)
• - niet bij diarree ontstaan na 3
  dagen hospitalisatie C. difficile
• - niet bij
  patiënten onder AB
• - samen met
  C. difficile in zz gevallen
• - virologie kindjes sneltesten
  afwachten
• werken met apart staal voor virologie
• Klinische info nuttig- reiziger, bestemming
• -
  immuungecompromitteerd
• - recent AB
  gebruik
• - recente
  hospitalisatie

54
Faeces parasieten in de toekomst

• Steeds Cryptosporidium kleuring belangrijk voor
  immuungecompromitteerden, reizigers, kinderen in
  kribbes
• Klinische verdenking amoebendysenterie en
  positief parasietenonderzoek PCR ter
  differentiatie E. histolytica en niet-pathogene
  E. dispar kan ( ITG om de twee weken, vers
  staal)
• Verdacht voor parasieten in faeces met een eerste
  negatief staal tweede, evt derde staal van
  verschillende dagen. Verdenking voor Giardia
  herhaalde microscopie, of antigentest (wordt
  geëvalueerd)
• TX-kandidaten Strongyloides uitsluiten indien
  verblijf in risicogebied in voorgeschiedenis

55
Faeces parasieten TO DO

• Aanvraagformulier - faeces parasieten
  (chronische diarree)
• Aanvraagformulier - 4 extra velden bij faeces
  parasieten
• reiziger
• 
  immuuungedeprimeerd
• 
  recent AB-gebruik
• 
  hospitalisatie sinds
• Contacteren van clinicus indien - 5-day-rule
  overschreden
• - recent AB gebruik
• 
  - parasieten samen met C. difficile
• 
  - parasieten samen met virologie
• Steeds Cryptosporidium kleuring

56
Faeces parasieten TO DO

• Bij detectie van E. histolytica rapporteren E.
  histolytica / E. dispar indien gewenst, kan
  staal doorgestuurd worden voor PCR
• Bij negatief resultaat geen parasieten
  gevonden Bij blijvende verdenking op een
  parasitaire infectie is herhaling van het
  onderzoek geïndiceerd ipv negatief
• Chronische diarree bij kinderen recipiënt met
  SAF ter beschikking stellen ter uitsluiting van
  D. fragilis?
• Nakijken TX protocols Strongyloides stercoralis
• Opleiding/ kwaliteitscontrole uitvoering faeces
  parasieten?
• - externe QC
• - interne QC