Microbiologia delle Micobatteriosi Prof. Giovanni Fadda Istituto di Microbiologia

1
Microbiologia delle MicobatteriosiProf.
Giovanni FaddaIstituto di Microbiologia U. C.
S. C. - Roma
Use the Best First (UBF) Workshop Antiinfettivi
2005 Roma 09-11 Marzo 2005
2
(No Transcript)
3
TUBERCOLOSI NEL MONDO
Ogni giorno 25000 persone si ammalano di TB
attiva circa 5000 muoiono di TB. 300,000
persone si infettano ogni anno con ceppi MDR-TB
4
Testimonianze archeologiche della tubercolosi

• Lesioni ossee in scheletri fossili risalenti a
  circa 8000 a.C.
• Degenerazioni riconducibili alla tubercolosi in
  mummie egizie del 2500 a.C.
• Rinvenimento di batteri con caratteristiche
  simili al M. tuberculosis in lesioni ossee di una
  mummia di un bimbo inca del 700 a.C.
• Determinazione di DNA di M. tuberculosis complex
  in tessuto osseo di un bisonte estinto, datato
  15000 anni a. C.
• (B. M. Rothschild et al., CID 2001, 33305-11)

5
La scoperta del M. tuberculosis

• 1819 Teofilo Lennec ipotizza lunicità delle
  manifestazioni cliniche della malattia

6

• 1865 Jan Antonine Villemin induce in conigli la
  Tubercolosi e fornisce per la prima volta la
  prova della sua natura infettiva

7

• 1882 Robert Koch, per la prima volta, isola e
  coltiva il Mycobacterium tubercolosis che da
  allora è anche conosciuto come bacillo di Koch

8
(No Transcript)
9
M. tuberculosis è la specie geneticamente più
vicina al ceppo ancestrale Le specie si sono
evolute e differenziate seguendo un processo di
delezione di frammenti di genoma La specie di
M. bovis è quella che ha subito il maggior numero
di delezione Tutti i ceppi di BCG presentano la
delezione della regione RD1 di M. tuberculosis
complex, che codifica per importanti fattori di
virulenza (Esat-6, CFP10, PPE68, etc.) Ne
consegue che M. bovis si è evoluto a partire dal
ceppo ancestrale di M. tuberculosis, e che
pertanto la tubercolosi è stata trasmessa
dalluomo agli animali e non viceversa.
10
Si stima (dati OMS) che circa 50 milioni di
persone siano infettate da micobatteri che
presentano farmaco-resistenze
11
Prevalence of drug resistance among new cases of
tuberculosis
12
La soluzione raccomandata dallOMS per il
problema rappresentato dai micobatteri multi
drug resistant è il protocollo DOTS (Directly
Observed Treatment-Short Course)
13
Il regime terapeutico DOTS, della durata di sei
mesi, prevede l'impiego simultaneo di almeno 3
farmaci l'isoniazide, la rifampicina e la
pirazinamide per i primi 2 mesi, rifampicina e
isoniazide per i restanti 4 mesi. In particolari
casi questi farmaci possono di volta in volta
essere integrati da streptomicina, etambutolo o
etionamide.
14

• Mycobacteria other than tubercle bacilli
  (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M.
  africanum) and M. lepraeare now are recognized as
  important human pathogens
• Some of these species can cause serious, even
  fatal, diseases in animals and humans. These
  microorganisms, once considered only
  environmental and saprophytic species, have been
  called by many names anonymous, opportunistic,
  atypical and opportunistic bacilli

15

• The terms non-tuberculous mycobacteria (NTM)
  and mycobacteria other than tubercle bacilli
  (MOTT) are preferable

16
Ecology of Nontuberculous Mycobacterial (1)

• Many nontuberculous mycobacteria are free-living
  saprophytes that have been detected in and
  isolated from a wide variety of environments,
  including water, soil, dust, and aerosols.
• In addition to their presence in natural
  environments, nontuberculous mycobacteria have
  been recovered from drinking-water distribution
  systems throughout the world.

17
Ecology of Nontuberculous Mycobacterial (2)

• The highest rates of NTM colonization in potable
  water systems are found in hospitals and
  hemodialysis and dental offices, with rates
  ranging from 60 to 100.
• The resistance of nontuberculous mycobacteria to
  disinfection undoubtedly contributes to the
  ability of a number of nontuberculous
  mycobacteria (e.g., Mycobacterium xenopi, M.
  avium, M. fortuitum, and M. chelonae) to persist
  in drinking-water systems

18
The Runyon classification and characteristics of
clinically significant nontuberculous
mycobacteria (NTM)
Species (Runyon group) Ideal temp. for growth Time for growth, days Colony morphology Comments
Photochromogens (I) M. kansasii M. marinum 37 C 30 C 10-20 5-10 Yellow (with light) Deep yellow (with light), smooth to rough Occasional scotochromogenic or nonchromogenic strains Water exposure
Scotochromogens (II) M. szulgai M. xenopi M. gordonae 37 C 42 C 37 C 10-25 15-30 10-15 Orange, smooth to rough Yellow and rough Deep yellow-orange and smooth Photochromogen at 25 C Occasionally non pigmented
Nonphotochromegens(III) M. avium M. haemophilum 37 C 30 C 10-20 15-20 3 variants smooth-opaque raised, smooth- transparent flat, rough Smooth to rough Smooth-transparent flat colonies tend to be more Virulent
Rapid growers (IV) M. fortuitum M. chelonae 37 C 28C 3-5 3-5 Transparent to cream- colored smooth Transaparent to cream-colored smooth May grow on 5 sheep blood agar May grow on 5 sheep blood agar
19
Importanza delle infezioni sostenute da MNT

• In Svizzera, dal 1983 al 1988, lincidenza della
  tubercolosi è passata da 16,2 a 13,2 casi per
  100.000 abitanti, mentre quella delle
  micobatteriosi da MNT da 0,4 a 0,9 per 100.000
  abitanti (Debrunner M et al., CID, 1992).
• In Inghilterra, nel 1970, veniva isolato 1 MNT
  ogni 60 M. tuberculosis, mentre nel 1992 si è
  passati ad un rapporto di 1 MNT per 6 M.
  tuberculosis (Yates, JCM, 1995).
• Infine, in Europa e negli USA è stato riportato
  che dal 25 al 50 dei pazienti con AIDS è affetto
  da micobatteriosi non tubercolari.

20
Incidence rates (per 100,000 population) of
disease due to nontuberculous mycobacteria in the
Northern Territory of Australia,19891997
OBrien DP, et al.. (2000) CID Vol. 31, 958-967
21
Association of species of nontuberculous
mycobacteria (NTM) with clinical categories of
nosocomial infection
Clinical category M. avium Rapid growers M. xenopi M. kansasii M. gordonae Other NTM
Disseminated infection in immunocompromised patients
Respiratory tract colonization/infection
Infections related to hemodialysis
Peritonitis associated with CAPD
Injection associated cutaneous and joint infections
Intravascular catheter infections
Surgical infections
NOTE. CAPD, continuous ambulatory peritoneal
dialysis rarely associated occasionally
associated frequently associated.
From Phillips and van Reyn, CID, 2001
22
Association of species of nontuberculous
mycobacteria (NTM) with types of nosocomial
pseudoinfection
Type of pseudoinfection M. avium Rapid growers M. xenopi M. marinum M. gordonae M. scrofulaceum
Contamination via endoscope or automated endoscope washer
Contamination in microbiology and pathology laboratory
Contamination in specimen collection
Generalized contamination of a variety of clinical specimens after colonization of hospital water systems
NOTE rarely associated occasionally
associated frequently associated.
From Phillips and van Reyn, CID, 2001
23

• Sulla base della sequenza del gene che codifica
  lRNA ribosomale 16S, sono state identificate più
  di 100 specie di micobatteri

24

• According to Wolinsky (1979) the following
  information is required for demonstrating that a
  particular nontuberculous mycobacterium was
  responsible for disease the species of
  Mycobacterium, the quantity of growth on primary
  culture, repeated isolations of the same organism
  from the specimec taken at different times, and
  the hosts risk factors

25
Chemotherapy of Nontuberculous Mycobacterial
Infections (1)

• Chemotherapy of nontuberculous mycobacterial
  infections has been problematic because of the
  relative resistance of nontuberculous
  mycobacteria to a wide range of antibiotics.
• Further, because most mycobacteria are
  intracellular pathogens, the mammalian host cells
  (e.g., macrophages) serve as a barrier to the
  delivery of drug to the intracellular
  environment.
• The relative hydrophobicity of nontuberculous
  mycobacteria is thought to restrict the activity
  of most hydrophilic drugs. An example is
  rifabutin, a hydrophobic derivative of rifampin,
  which has been shown to be effective in
  prophylaxis and treatment of nontuberculous
  mycobacterial infections

26
Chemotherapy of Nontuberculous Mycobacterial
Infections (2)

• There are a number of published guidelines for
  prophylaxis and treatment of nontuberculous
  mycobacterial infections, especially directed
  toward M. avium. These include American Thoracic
  Society Guidelines on the diagnosis and treatment
  of disease caused by nontuberculous mycobacteria
  and the reports of the U.S. Public Health Service
  Task Force on Prophylaxis and Therapy for M.
  avium complex.

27
Guidelines utilizzate per la cura delle
infezioni sostenute dalle più imporanti specie di
MNT
Falkinham JO. Clin. Microbiol. Rev. 1996
28
Antimicrobial activity for the three most
frequently isolated species of nonpigmented RGM
Antimicrobial agent Antimicrobial agent
Species gt 90 susceptible or intermediate ( if lt100) lt 90 susceptible or intermediate (approx. susceptibility/intermediate)
M. fortuitum group Amikacin, cefoxitin, ciprofloxacin, moxifloxacin, gatifloxacin, imipenem, levofloxacin, linezolid (96) Clarithromycin (80), doxycycline (46), vancomycin (38)
M. abscessus Amikacin (98), cefoxitin (95), clarithromycin Ciprofloxacin (lt1), doxycycline (4), imipenem (57), linezolid (48)
M. chelonae Amikacin (97), clarithromycin, moxifloxacin, gatifloxacin (96), linezolid (94), tobramycin Ciprofloxacin (19), doxycycline (26), imipenem (40)
From Brown-Elliott and Wallace, CMR, 2002
29
Diagnosis of mycobacterial infections by
conventional procedures
30
Terreni di coltura solidi più comuni per
micobatteri
Terreno Componenti Agenti inibitori
Lowenstein-Jensen (LJ) Proteine di uovo coagulate, sali, glicerolo, fecola di patate e RNA Verde malachite (penicillina, acido nalidixico)
Middlebrook 7H10 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo, destrosio, agar Verde malachite, cicloesimide, lincomicina, acido nalidixico
Middlebrook 7H11 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo, destrosio, agar, idrolizzato di casteina Carbenicillina, amfotericina B, polimixina B, trimethoprim
31
Modalità consigliate per la raccolta dei
materiali patologici per la ricerca di M.
tuberculosis e dei MNT
Materiale Modalità di raccolta Numero di campioni
Espettorato Primo mattino con o senza nebulizzazione Uno al giorno per 3/5 giorni
Urine Primo mattino raccolta completa Uno al giorno per 3/5 giorni
Liquor Puntura lombare Uno o più se possibile
Biopsie Escissioni o incisioni
Lente Escissioni o tampone
Broncoaspirato Aspirazione di secrezioni bronchiali
Succo gastrico Aspirazione di succo gastrico al primo mattino
Non utilizzare raccolte di 24 ore in quanto
fortemente contaminate con flora microbica non
specidica
32
Metodi di digestione, decontaminazione e
concentrazione dei campioni clinici per la
ricerca di M. tuberculosis e dei MNT
Metodo Commento
N-acetil-L-cisteina (NALC) 2 di NaOH Soluzione decontaminante (NaOH) agente mucolitico (NALC)
Ditiotreitolo 2 NaOH Azione mucolitica più efficace
13 di fosfato trisodico cloruro di benzalconio Azione antibatterica più blanda
Cloruro di cetilpiridinio 2 NaCl Utilizzato per la spedizione dei campioni
4 di NaOH Per campioni fortemente contaminati
4 di acido solforico Per la decontaminazione dei campioni di urina
5 acido ossalico Elimina Pseudomonas aeruginosa
33
Trattamento dei campioni clinici contenenti
micobatteri
Espettorato od altro campione clinico contaminato
Digestione con sputolisina
Campioni extrapolmonari non sterili
Decontaminazione con NaOH al 2 (conc. finale)
Campioni sterili
Centrifugazione a 1500xg
Risospendere e lavare 2 volte con PBS pH 7.2
risospendere con BSA priva di acidi grassi (0.2)
Esame microscopico diretto (Ziehl-Neelsen,
auramina)
Semina in LJ
Semina in terreno liquido
34
Sistemi di coltura in terreno liquido per
lisolamento di micobatteri da materiali clinici

• Metodi radiometrici
• BACTEC 460 TB
• Metodi non radiometrici
• BACTEC 9000 MB
• Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)
• MGIT 460
• MGIT 960
• MB/BacT System
• ESP Culture System II

35
Journal of Clinical Microbiology, May 1984,vol.
19720-1
Recovery and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis from extrapulmonary
specimens by the BACTEC radiometric method Fadda
G1, Roe SL2 Medical Microbiology Department1,
University of Sassari, Sassari, Italy and Becton
Dickinson Laboratory Systems2, Mechlin, Belgium
36
Tecnologia a fluorescenza
Ruthenium complex
37
Tecnologia a fluorescenza
Coltura Positiva
Coltura Negativa
Forte fluorescenza
Poca o nessuna fluorescenza
38
BACTEC 9000MB

• Monitoraggio continuo in fluorescenza, non
  invasivo
• Risultati significativamente più veloci rispetto
  ai terreni solidi
• Flacone Myco/F Sputa per tutti i campioni
• Flacone specifico per il sangue Myco/F Lytic
• 2000 campioni/anno (20-40 settimana)
• Curve, referti di positività

39
Journal of Clinical Microbiology, 1997,
35(8)2072-5
Evaluation of a nonradiometric system (BACTEC
9000 MB) for detection of mycobacteria in human
clinical samples Zanetti S2, F. Ardito1, L.
Sechi2, M. Sanguinetti1, P. Molicotti2, G.
Delogu2, M. P. Pinna2, A. Nacci1, and G. Fadda1
Istituto di Microbiologia1, Universita
Cattolica del S. Cuore, Rome and Dipartimento di
Scienze Biomediche, Sezione di Microbiologia
Sperimentale e Clinica2, Universita degli Studi
di Sassari, Italy
40
MGIT 460

• Risultati rapidi
• Utilizzo semplice
• Non invasivo e non radiometrico
• Per laboratori con 1-20 campioni/settimana
• Disponibile AST

41
New Microbiologica, 2000, 23 (2) 151-158
Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator
Tube (MGIT) with radiometric and solid culture
for isolation of Mycobacteria from clinical
specimens and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis Ardito F.1, M.
Sanguinetti 1, L. Sechi 2, B. Posteraro 1, L.
Masucci 1, G. Fadda 1 and Stefania Zanetti 2
Istituto di Microbiologia1, Universita
Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro Cardiologico
"Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto di
Microbiologia C. A. Romanzi, Università di
Genova, Genoa, Italy3
42
BACTEC MGIT 960 strumento a monitoraggio
continuo

• Crescita ed Isolamento Antibiogramma in completa
  automazione (2000)
• Utilizza la tecnologia BBL MGIT già esistente
• Sicurezza
• Non utilizzo di aghi
• provette in plastica
• Per laboratori che processano un elevato numero
  di campioni
• fino 8000 colture/anno

Hanna, B. A. et al. 1999. Multicenter evaluation
of the BACTEC 960 System for recovery of
mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 37
782-784. Tortoli E. et al. 1999 Use of BACTEC
MGIT 960 for recovery of mycobacteria from
clinical specimens multicenter study. J. Clin.
Microbiol. 37 3578-3582.
43
LA TECNOLOGIA COLORIMETRICA (MB/BacT)

• La chimica della crescita microbica
• La crescita degli organismi in un brodo di
  coltura produce una variazione in CO2
• La CO2 abbassa il pH
• Il sensore diventa giallo
• Il sensore del flacone
• Sensore colorimetrico impregnato di silicone
• Sensibile ai cambiamenti in CO2
• Cambio di colore permanente
• giallo Positivo

44
Metodi fenotipici di identificazione dei
micobatteri

• Caratterizzazione del pattern biochimico
• Analisi degli acidi micolici della parete
  micobatterica mediante HPLC e gas-cromatografia

45
Pattern degli acidi micolici in HPLC di alcune
specie micobatteriche
A Mycobacterium asiaticum B M. bovis C M.
gastri D M. gordonae E M. kansasii F M. leprae
Da Butler WR, CMR, 2001
46
Metodi per la determinazione della sensibilità ai
farmaci di M. tuberculosis

• Metodo proporzionale (MOP) (metodo di
  riferimento)
• Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB)
• Metodo MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube)
• E-test (sia M. tuberculosis che NTM)

47
BBL MGIT 4 ml AST

• La procedura prevede lutilizzo di 5 provette
  MGIT.
• Le provette contengono quantità standardizzata di
  antibiotico
• STR 0.8 mg/mL
• INH 0.1 mg/mL
• RIF 1.0 mg/mL
• ETH 3.5 mg/mL
• Controllo di Crescita (GC)

48
New Microbiologica, 2000, 23 (2) 151-158
Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator
Tube (MGIT) with radiometric and solid culture
for isolation of Mycobacteria from clinical
specimens and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis Ardito F.1, M.
Sanguinetti 1, L. Sechi 2, B. Posteraro 1, L.
Masucci 1, G. Fadda 1 and Stefania Zanetti 2
Istituto di Microbiologia1, Universita
Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro Cardiologico
"Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto di
Microbiologia C. A. Romanzi, Università di
Genova, Genoa, Italy3
49
Antibiogramma automatico SIRE
Ardito, Zanetti, Fadda et al. J. Clin.
Microbiol., 2001 Bemer et al.,. J. Clin.
Microbiol., 2002
50
Journal of Clinical Microbiology, December
2001,vol. 39 4440-4444
Evaluation of the BACTEC Mycobacteria Growth
Indicator Tube (MGIT 960) automated system for
drug susceptibility testing of Mycobacterium
tuberculosis Fausta Ardito1, Brunella
Posteraro1, Maurizio Sanguinetti1, Stefania
Zanetti2, and Giovanni Fadda1 Istituto di
Microbiologia, Università Cattolica del Sacro
Cuore, Rome1, and Dipartimento di Scienze
Biomediche, Sezione di Microbiologia, Università
di Sassari, Sassari2, Italy
51
Principali sequenze geniche utilizzate per
lidentificazione di MNT

• Gene che codifica la heat shock protein da 65 kDa
  (hsp65)
• Gene che codifica la subunità b dellRNA
  polimerasi (rpoB)
• Gene che codifica lRNA ribosomale 16S e sequenze
  intergeniche 16S-23S (ITS)
• Sequenze ripetitive disperse nel genoma

52
Gene che codifica lRNA ribosomale 16S

• E la sequenza genica che meglio riflette le
  relazioni filogenetiche tra i batteri, a causa di
  un tasso di mutazione basso e costante nel tempo,
  tanto che può essere considerata un orologio
  molecolare.
• Per questo motivo la variabilità interspecifica è
  piuttosto bassa (per i micobatteri varia dal 94.3
  al 100).
• Daltro canto la variabilità intraspecifica è
  praticamente nulla, a differenza del gene hsp65 e
  rpoB.
• Nellambito del gene sono state individuate
  (Kirschner et al., JCM, 1993 Rogal et al., JGM,
  1990) due regioni ipervariabili, A (da 129 a 267
  bp) e B (da 430 a 500 bp), la cui analisi
  consente una valida identificazione delle varie
  specie di micobatterio.

53
Journal of Clinical Microbiology, June 1998,
p.1530-1533
Routine Use of PCR-Reverse Cross-Blot
Hybridization Assay for Rapid Identification of
Mycobacterium Species Growing in Liquid Media M.
SANGUINETTI1, B. POSTERARO1, F. ARDITO1, S.
ZANETTI2, A. CINGOLANI3, L. SECHI2, A. DE LUCA3,
L. ORTONA3, AND GIOVANNI FADDA1 Istituto di
Microbiologia1 and Clinica delle Malattie
Infettive3, Universita Cattolica del S. Cuore,
Rome and Dipartimento di Scienze Biomediche,
Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica2,
Universita degli Studi di Sassari, Italy
54
PCR-Reverse Cross Blot Hybridization
PCR with pMyc 14 (5 biotinilated) and pMyc7 as
primers
dTTP-tailing and fixing of species-specific
oligonucleotide probes (1-7) to nylon membrane
Biotine
Target DNA
1 2 3 4 5 6
7
Hybridization of biotinilated PCR-product to
oligonucleotide probes on nylon membrane
Incubation with streptavidin-AP and a color
substrate
1 2 3 4 5 6
7
Detection of DNA-DNA hybrids by colored
precipitate
55
Analysis by reverse cross-blot hybridization of
PCR products from 13 mycobacterial species
1Mycobacterium tuberculosis, 2 M. avium, 3 M.
intracellulare, 4 M. fortuitum, 5 M. gordonae,
6 M. xenopi, 7 M. chelonae, 8 M. genavense, 9
M. kansasii, 10 M. malmoense, 11 M. marinum,
12 M. smegmatis, 13 M. terrae
Sanguinetti M., Fadda G., et al. JCM, 1998,
361530-3
56
Journal of Clinical Microbiology, September
2002,vol. 40 3499-3501
Early detection of negative BACTEC MGIT 960
cultures by PCR-reverse cross blot hybridization
assay L. Romano1, M. Sanguinetti1, B.
Posteraro1, F. Ardito1, G. Gesu2, A. M. Schito3,
and G. Fadda1 Istituto di Microbiologia1,
Universita Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro
Cardiologico "Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto
di Microbiologia C. A. Romanzi, Università di
Genova, Genoa, Italy3
57
PCR-reverse cross blot hybridization as early
negative predictor for BACTEC MGIT 960 liquid
cultures
549 clinical samples
SET B
SET A
Time
Inoculation in MGIT 960
0
Inoculation in MGIT 960
7days
1 ml aliquot was taken and analyzed by
PCR-reverse cross hybridization
Monitoring for growth detection
Endpoint
Endpoint
42days
Da Romano, Fadda et al. J. Clin. Microbiol., 2002
58
Comparison of results between MGIT 960 and
PCR-reverse cross blot hybridization
Clinical specimens Specimens positive by MGIT (65) Specimens positive by MGIT (65) Specimens negative by MGIT (484) Specimens negative by MGIT (484) Sensitivity () Specificity () Specificity () PPV () NPV ()
PCR pos PCR neg PCR pos PCR neg
Total (549) 64 1 0 484 98.4 100 100 100 99.8
Respiratory (446) 58 0 0 388 100 100 100 100 100
Non-respiratory (103) 6 1 0 96 85.7 100 100 100 98.9
PPV Positive predictive value NPV Negative
predictive value
From Romano, Fadda et al. J. Clin. Microbiol.,
2002
59
Br. J. Dermatology, 139, 872-876, 1998
POLYMERASE CHAIN REACTION-REVERSE CROSS-BLOT
HYBRIDIZATION ASSAY IN THE DIAGNOSIS OF
SPOROTRICHOID MYCOBACTERIUM MARINUM
INFECTION POSTERARO B.1, SANGUINETTI M.1,
GARCOVICH A.2, ARDITO F.1, ZAMPETTI A.2, MASUCCI
L.1, SBORDONI G.2, CERIMELE D.2, FADDA G.1
1Istituto di Microbiologia, e 2Clinica
Dermotologica Università Cattolica del S. Cuore,
Roma, Italia
60
Histological section of the skin biopsy
Demonstrating dermal inflammation in a
perivascular distribution, with tuberculoid
granulomas showing a predominance of giant cells
From Posteraro, Fadda et al., Br. J. Dermatol,
1998
61
Identificazione molecolare di M. marinum
From Posteraro, Fadda et al., Br. J. Dermatol,
1998
62
Utilità della PCR-Reverse Cross Blot
Hybridization per lidentificazione di rare o
nuove specie di micobatteri
Clonaggio e sequenza del frammento di rDNA
16S amplificato
Campione clinico o ceppo in esame
PCR-reverse hybridization
Sonda genere specifica
Identificazione e disegno di una nuova sonda
specie-specifica
PCR-reverse hybridization
Confronto con le sequenze di rDNA del GenBank
Sonda specie specifica
Sonda genere specifica
63
Identificazione di Mycobacterium triplex mediante
PCR-Reverse Cross Blot Hybridization
M. avium M. chelonae M. fortuitum M. genavense M.
gordonae M. intracell. M. kansasii M.
malmoense M. marinum M. smegmatis M. terrae M.
tuberculosis M. xenopi Mycobacterium spp
Clonaggio e sequenza del frammento di rDNA
16S amplificato
PCR-reverse hybridization
Campione clinico (liquido sinoviale)
M. avium M. chelonae M. fortuitum M. genavense M.
gordonae M. intracell. M. kansasii M.
malmoense M. marinum M. smegmatis M. triplex M.
tuberculosis M. xenopi Mycobacterium spp
Completa omologia con lrDNA 16S di M. triplex e
disegno di una sonda specie-specifica
Confronto con le sequenze di rDNA del GenBank
PCR-reverse hybridization
Cingolani, Fadda et al, CID (2000), 31 (1) 177-9
64
(No Transcript)
65
Metodi molecolari utilizzati per la rivelazione
della resistenze in M. tuberculosis

• Tecniche basate sullelettroforesi
• PCR-SSCP(Single Strand Conformational
  Polymorphisms)
• Analisi degli heteroduplex (DG-DGGE, RNA/RNA
  mismatch assay)
• PCR-DNA sequencing
• Tecniche basate sullibridazione
• Ibridazione in fase solida (Inno LiPA Rif. TB)
• Ibridazione in micropiastra
• Ibridazione su array
• PCR real-time
• TaqMan probe
• Molecular beacons
• FRET probes

66
DNA Fingerprinting
67
Journal of Clinical Microbiology, Apr. 1993, p
767-770
The Resurgence of Tuberculosis Is Your
Laboratory Ready? FRED C. TENOVER, JACK T.
CRAWFORD, ROBIN E. HUEBNER, LARRY J. GEITTER, C.
ROBERT HORSBURGH. JR., AND ROBERT C. GOODCDC
Atlanta

• RECOMMENDATIONS
• Promote the rapid delivery of specimens to the
  laboratory on a day basis (24h).
• Inoculate a liquid medium as primary culture,
  and include inoculation of a slant of LJ medium.
• Identify growth in liquid medium as acid fast
  and use probes, NAP, mycolic acid patterns or
  other molecular tests, i. e. PCR reverse
  hybridization, to identify as M. tuberculosis or
  MOTT as soon as possible.
• Determine the susceptibilities of M.
  tuberculosis isolates to primary drugs in a
  BACTEC or similar systems (MGIT).
• Maintain up-to-date records
• Review all laboratory procedures and facilities
  to garantee safety of workers.
• Acid fast examinations of specimens in 24h (Use
  a fluorescent acid-fast staining)
• Identifications of M. tuberculosis within 10-14
  days
• Reports of drugs susceptibility test within
  15-30 days

68
Università Cattolica del S. Cuore - Roma
Università di Sassari

• Istituto di Microbiologia
• G. Fadda
• F. Ardito
• G. Delogu
• B. Posteraro
• M. Sanguinetti
• L. Romano

• Istituto di Microbiologia
• e Virologia
• S. Zanetti
• L. Sechi
• P. Molicotti