Enfeksiyon Hastaliklarinin Tanisinda

1
Enfeksiyon Hastaliklarinin Tanisinda Real-Time
PCR Uygulamalari
Y.Bio.Tanju BASMACI
2
PCR
PCR
PCR
Neden PCR Kullanmaliyiz ?

• Yüksek hassasiyet
• Organizmanin izole edilmeden arastirilma imkani
• Hizli (lt 24 saat)

3
real-time
real-time
real-time PCR
real-time
hardware
4
real-time
real-time
real-time
real-time
PCR
Amplifikasyonarastirma
Entegre sistem
Sürekli izleyebilme
fluoresan problar
Hizli sonuç
Kisa döngü zamani
Düsük kontaminasyon riski
Kapali sistem
Deney dizayni
Nicel(quantitative)sonuç
5
real-time
real-time
TaqMan
real-time
hardware
ABI Biosystems
ABI 7700

• Microtitre plate format, kapali sistem
• 96 örnegin 2½ saatte çalisilabilmesi
• Real-time amplifikasyon ve arastirma
• Quantitif (nicel) sonuç
• Reporter ve quencher boyali Fluorogenic prob
  kullanimi
• Taq DNA polymerazin 5-3 exonucleaz
  aktivitesiyle kullanim

6
real-time
real-time
real-time
real-time
TaqMan
Isinim
Uyarim
FRET
Amplicon
Baglanma
Uzama
Amplicon
5-3 exonuclease
7
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Hardware

• Real-time arastirma
• Quantitatif sonuç
• Hibridizasyon prob kullanimi
• 2 hedefin es zamanli arastirilma imkani
• Kapiller kullanimi (10-20ul)
• 32 örnegin / 60 dakikada incelenmesi
• Kapali sistem kontaminasyondan korunma

8
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Uygulama
9
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Hardware
10
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Komsu hibridizasyon problarinin kullanimiyla FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer)

FRET

Red 640
Phosphate

Isinim
Amplicon
11
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Operation
12
95oC
Denatürasyon
13
Isinim
Tm
55oC
Primer/Probe Baglanma
14
(No Transcript)
15
72oC
Primer Uzama
16
real-time
real-time
LightCycler
real-time
Uygulamalar

• Enfeksiyon hastalik ajanlarinin arastirilmasi
• Hedef karekterizasyonu
• Mikrobiyal belirleme (Quantifikasyon)

17
real-time
real-time
LightCycler
HSV (Herpes Simplex Virus) nin melting curve ile
tanimlanmasi
real-time
Uygulama
HSV
DNA pol
HSV 1 ve 2 için genel primer
18
HSV 1
HSV 2