Stanoven koncentrace kvantifikace proteinu

1
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinu

• Bioanalytické metody (KBC/BAM)
• Prof. RNDr. Pavel Pec, CSc.

2
Úvod

• Kritéria výberu metod stanovení koncentrace
  proteinu jsou zaloena na monostech pro vlastní
  analýzu, mnoství a charakter analyzovaného
  proteinu, prítomnosti interferujících látek a
  poadavkem na presnost.
• Napr. Lowryho metoda je velmi citlivá, ale na
  druhé strane je dvoustupnová a vyaduje minimální
  dobu inkubace 40 min.
• Metoda dle Bradfordové je mnohem citlivejí a
  výsledek mueme znát ji za 5 minut, avak pro
  proteiny s velmi nízkým obsahem argininu je
  nepouitelná.
• Problém odhadu obsahu a charakteru proteinu je v
  tom, e jako standard pouíváme cistý protein,
  ale analyzujeme obvykle smes, nebo protein o
  neznámém aminokyselinovém sloení.
• Kriteria budou diskutována u jednotlivých metod.
• Literatura pro podrobnejí studium Stoscheck,
  C.M. Quantitation of Protein. Methods in
  Enzymology 182 50-69 (1990).

3
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinu
Velmi duleitá analýza bez drahých instrumentu.
Dnes se preferují spektrofotometrické metody,
stanovení dusíku (po mineralizaci) pri
Kjeldahlove metode, nebo gravimetrie a
refraktometrie ji patrí minulosti.
1. Biuretová metoda reakce peptidové vazby s
Cu(II) v alkalickém prostredí. Tvorí se
modrofialové zbarvení, lmax 540 nm. Cinidlo
obsahuje CuSO4, vínan sodno-draselný a NaOH.
Nutný standard (BSA, ovalbumin), metoda nezávisí
na aminokyselinovém sloení, ale je málo citlivá
(cca 10 - 100 mg/mL). Ruí napr. NH4, Tris. 2.
Lowryho metoda, od roku 1951, modif. 1972,
citlivost 1 mg/mL, jedna z nejcitovanejích prací
(viz obr.). Citlivost biuretové metody zvýena
prídavkem Folin-Ciocalteauova fenolového cinidla.
4
biuret ? Lowry?
5
Lowryho metoda mnohem více závisí na sloení
proteinu. K reakci peptidové vazby s Cu2
prispívá redukce fosfomolybdenanu a
fosfowolframanu tyrosinem (ale i tryptofanem a
cysteinem). Principem je nejprve provedení
biuretové reakce a pak prídavek Folinova
cinidla. Merí se pri 650 nm (750 nm), iroká
absorpce, pro kalibraci nutné standardy (BSA,
OVA). Vyí citlivost ne biuretová reakce (2-100
mg/mL), zbarvení vak není v case stabilní. Ruí
napr. NH4. 3. BCA metoda od 1985, citlivost 0,
5 mg/ml, vyuívá sodné soli kyseliny
bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty
Cu(I) tvorené reakcí peptidové vazby s Cu(II).
Cinidlo se pripravuje smísením roztoku sodné soli
BCA v alkalickém prostredí (100 dílu) a CuSO4 (1
díl). Merí se pri 562 nm, citlivost na úrovni
Lowryho metody, mení interference (NH4 ano).
Kalibrace na standardy (BSA).
6
BCA method

• Colorimetric method read at 562 nm
• Compatible with most ionic and nonionic
  detergents
• Faster and easier than the Lowry method
• All reagents stable at room temperature for 2
  years
• Working reagent stable for 24 hours
• Linear working range for BSA from 20-2,000 µg/ml
• Minimum detection level of 5 µg/ml with the
  enhanced protocol
• Adaptable to microplates
• Less protein-to-protein variation than
  dye-binding methods
• Applications
• Studying proteinprotein interactions
• Measuring column fractions after affinity
  chromatography
• Estimating percent recovery of membrane proteins
  from cell extracts
• High-throughput screening of fusion proteins

7
Reaction schematic for the bicinchoninic acid
(BCA)-containing protein assay.
8
(No Transcript)
9
Time comparison of BCA Protein Assay Reagent vs.
Lowry Protein Assay

• BCA Protein Assay Reagent1. Mix reagents 1
  minute2. Add sample and incubate 30 minutes3.
  Read at 562 nm 1 minuteTotal BCA Time 32
  minutesLowry Protein Assay1. Make reagents 70
  minutes2. Add sample and incubate 20 minutes3.
  Add Folin Reagent 1 minute4. Incubate 30
  minutes5. Read at 750 nm 1 minuteTotal Lowry
  Time 122 minutes

10
4. Metoda Bradfordové principem je adsorpcní
vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na
molekulu proteinu. Citlivost 1 mg/mL. Závisí na
obsahu bazických (zvl. Arg), ale i aromatických
aminokyselin. Metoda je velmi populární, protoe
je rychlá (5 min), mnoství látek vak
interferuje, negativne zejména detergenty (SDS,
Triton). Nedává tedy tak spolehlivé výsledky jako
obdobne citlivá BCA metoda, kde tyto látky
neruí. Citlivost je 5 x vyí ne u Lowyho
metody, lineární kalibrace max. po 20 mg
proteinu. Cinidlo (vodný roztok) obsahuje
barvivo, ethanol a H3PO4. Barva hnedá, po reakci
s proteinem intenzivne modrá, lmax 595 nm.
Vechny dosud zmínené metody jsou destruktivní,
vzorek je pro dalí analýzu nepouitelný!
11
This high performance Bradford reagent
exhibits substantially increased linearity of
response, and only half the expected
protein-to-protein variation of other commercial
Bradford protein assays.

• Detects protein concentrations from 1-1,5 µg/ml
• Ready-to-use dye-binding reagent formulation
• Fast (almost immediate) color development read
  at 595 nm
• Compatible with reducing sugars, reducing
  substances and thiols (Table 1.)
• Refrigerated reagent is stable for 2 years
• Superior linear response over the range of
  125-1,500 µg/ml
• Adaptable to microplates
• Micro protocol useful for protein concentrations
  from 1-25 µg/ml

12

• Use of Coomassie G-250 Dye in a colorimetric
  reagent for the detection and quantitation of
  total protein was first described by Dr. Marion
  Bradford in 1976. In the acidic environment of
  the reagent, protein binds to the coomassie dye.
  This results in a spectral shift from the
  reddish/brown form of the dye (absorbance maximum
  at 465 nm) to the blue form of the dye
  (absorbance maximum at 610 nm) (Figure 1). The
  difference between the two forms of the dye is
  greatest at 595 nm, so that is the optimal
  wavelength to measure the blue color from the
  coomassie dye-protein complex. If desired, the
  blue color can be measured at any wavelength
  between 575 nm and 615 nm. At the two extremes
  (575 nm and 615 nm) there is a loss of about 10
  in the measured amount of color (absorbance)
  compared to that obtained at 595 nm.

13
(No Transcript)
14

• Development of color in coomassie dye-based
  (Bradford) protein assays has been associated
  with the presence of certain basic amino acids
  (primarily arginine, lysine and histidine) in the
  protein. Van der Waals forces and hydrophobic
  interactions also participate in the binding of
  the dye by protein. The number of Coomassie dye
  ligands bound to each protein molecule is
  approximately proportional to the number of
  positive charges found on the protein. Free amino
  acids, peptides and low molecular weight proteins
  do not produce color with coomassie dye reagents.
  In general, the mass of a peptide or protein must
  be at least 3,000 daltons to be assayed with this
  reagent. The assay is performed at room
  temperature and no special equipment is required.
  Simply add the sample to the tube containing
  reagent and the resultant blue color is measured
  at 595 nm following a short room-temperature
  incubation. The coomassie dye containing protein
  assay is compatible with most salts, solvents,
  buffers, thiols, reducing substances and metal
  chelating agents encountered in protein samples.

15
Nevýhoda

• The main disadvantage of coomassie-based
  (Bradford) protein assay is its incompatibility
  with surfactants at concentrations routinely used
  to solubilize membrane proteins. In general, the
  presence of a surfactant in the sample, even at
  low concentrations, causes precipitation of the
  reagent. Since the coomassie dye reagent is
  highly acidic, a small number of proteins cannot
  be assayed with this reagent due to their poor
  solubility in the acidic reagent. Also, coomassie
  reagents result in about twice as much
  proteinprotein variation as copper chelation
  based assay reagents. In addition, coomassie dye
  stains the glass or quartz cuvettes used to hold
  the solution in the spectrophotometer while the
  color intensity is being measured. (Cuvettes can
  be cleaned with strong detergent solutions and/or
  methanol washes, but use of disposable
  polystyrene cuvettes eliminates the need to clean
  cuvettes.)

16
Typical color response curves for BSA and BGG
using the Coomassie Plus The Better Bradford
Assay Reagent (BGGbovine gamma globulin) .
17
Linearita Bradfordové metody

• The Better Bradford Assay is linear from 125 to
  1,000 µg/ml. When using bovine gamma globulin
  (BGG) as the standard, the Coomassie Plus The
  Better Bradford Assay is linear from 125 to 1,500
  µg/ml.

18
Coomassie Dry Protein Assay Plates 
19
5. Prímá spektrofotometrická stanovení (UV
oblast) díky prítomnosti chromoforu v molekulách
proteinu, které absorbují v UV oblasti spektra.
Velkou výhodou je, e jde o nedestruktivní
metodu. Pracuje se s kremennými kyvetami, nikoli
sklo ani plast. V blízké UV oblasti (280 nm)
není velká citlivost 50 mg / mL, v daleké UV
oblasti (205 nm) pak dochází ke znacné
interferenci. Samozrejme je zde velká závislost
na aminokyselinovém sloení proteinu. Vzhledem k
tomu, e UV absorpce je dána aromatickými AK
(hlavne Trp a Tyr), je nutná jejich prítomnost.
Interference irokého absorpcního pásu nukleových
kyselin (lmax 260 nm) se eliminuje merením pri
dvou vlnových délkách a pocetní korekcí. V
daleké UV oblasti se vyuívá vlnová délka 205 nm
(maximum absorpce peptidové vazby je pri 192 nm).
20
(No Transcript)
21
Pri merení v daleké UV oblasti je nutno precizne
volit pufr (aby neabsorboval), vzorky by mely být
zbaveny malých cástic (a tím i opalescence)
centrifugací, pokud mono bez velkého obsahu O2.
Vzorce pro prímé UV stanovení c (mg/mL) 1.55
A280 - 0.76 A260 c (mg/mL) (A235 - A280)/2.51 c
(mg/mL) (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) A205 27
120 (A280/A205)
6. Edelhochova metoda pri znalosti
aminokyselinového sloení je moné spocíst
extinkcní koeficient proteinu e280. Podmínkou je
prítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v
molekule. e280 nTrp.5500 nTyr.1490
nCys.125 (M-1.cm-1)
22
7. Fluorescencní stanovení fluorimetrické
stanovení proteinu je zaloeno na reakci
primárních aminoskupin v proteinu (Lys, N-koncová
aminoskupina) s o-ftalaldehydem. Citlivost metody
mue být zvýena hydrolýzou proteinu pred
merením. Ruí pufry s obsahem primárních
aminoskupin (Tris), nejlépe pouít borátový pufr,
pH 10.4. Merí se po prídavku hydroxidu
sodného, excitacní vlnová délka 340 nm, emise
mezi 440 a 455 nm. Kadý vzorek se merí pouze
jednou, ozárení sniuje intenzitu fluorescence.
23
Protocol for Quantiation of Proteins using
NanoOrange

• Protein concentrations as low as 10 ng/mL can be
  measured. This level of sensitivity is much
  superior to spectrophotometric techniques such as
  the BCA method (0.5 µg/mL), the Bradford assay (1
  µg/mL), the Lowry assay (1 µg/mL), or 280 nm
  absorbance (50 µg/mL). (1-4)The NanoOrange assay
  also shows less protein-to-protein variability
  than the Bradford assay.

24
Protocol for Quantiation of Proteins using
NanoOrangeInvitrogen.

• To perform a protein assay, the protein sample is
  simply added to the NanoOrange reagent in a
  specialized diluent and this mixture is heated at
  95 C for ten minutes. Fluorescence can be
  measured as soon as the mixture has cooled to
  room temperature. Alternatively, samples can be
  read up to six hours after preparation with no
  loss in sensitivity, as long as samples are
  protected from light.
• The NanoOrange reagent is virtually
  nonfluorescent in aqueous solution, becoming
  strongly fluorescent at about 570590 nm upon
  interaction with proteins, when excited at about
  470490 nm. Detection of the fluorescence using
  the TD-700 fluorometer equipped with a
  fluorescein filter kit allows protein
  concentrations from 10 ng/mL to 10 µg/mL to be
  accurately measured relative to a standard curve

25
Full-range calibration plot for bovine serum
albumin (BSA) using the TD-700 Fluorometer and
the NanoOrange Protein Quantitation Kit.
26
Low-range calibration plot for bovine serum
albumin (BSA) using the TD-700 Fluorometer and
the NanoOrange Protein Quantitation Kit.
27
Stanovení proteinu (Protein quantitation)

• Absorpce pri 280 nm (semi-kvantitativní)
• Absorpce zpusobená tryptofanovými (tyrosinovými)
  zbytky.
• Výhoda rychlá, nedestruktivní
• Nevýhody
• - ruí látky s absorpcí pri 280 nm
• - ruzná absorpce ruzných proteinu
• z duvodu ruzných obsahu Trp
• Výpocet A280 1 odpovídá 0.5 2 mg.ml-1
  proteinu
• Kolorimetrické metody
• (Mikro-)biuretová metoda Komplex Cu2 s
  peptidovými vazbami (-CO-NH-) v alkalickém
  prostredí ? Cu-protein komplex, absorbance pri
  570 nm
• Lowry stanovení Prenos elektronu z navázaných
  mednatých iontu a z aromatických vedlejích
  skupin na Folinovo cinidlo
• Stanovení dle Bradfordové Adsorpce Coomassie
  Brilliant Blue G250 na protein (hlavne Arg, ale
  také His, Lys, Trp, Tyr a Phe vedlejí retezce)
• Stanovení s bicinchoninovou kyselinou chelatace
  medného iontu s BCA

28
Srovnání nejbenejích metod stanovení proteinu