TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

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TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

• Rta inmune adaptativa mediada por linfocitos es
  estudiada mediante
• Aislamiento ? Separación
  poblaciones-subpoblaciones ? comportamiento
• No es posible diferenciar los linfocitos T de los
  B por microscopía ordinaria, ni en la sangre ni
  en los órganos linfoides,  aunque sí se observan
  algunas diferencias por microscopía electrónica
  de barrido. No obstante, se disponen de varios
  métodos que permiten diferenciar y cuantificar
  los linfocitos, sus diferentes subpoblaciones e
  incluso su capacidad de responder a distintos
  antígenos. Los métodos para el estudio de los
  linfocitos, más utilizados en la actualidad, los
  podemos agrupar en
• .- Determinación de
  marcadores y receptores de
• membrana.
• .- Determinación de
  antígenos de membrana.
• .- Pruebas funcionales.

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TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

• Aislamiento de linfocitos Gradiente sobre
  Ficoll/Hypaque (Boyum 1968)
• Humanos Sangre
  Periférica Organos
• M. experimental
  bazo, NL, timo

Importante conocer si se requiere esterilidad .
Rendimiento 1-2 x 106cel / ml
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TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

• 1.- Marcadores y receptores de membrana.
• Estos métodos han sido tradicionalmente
  utilizados para diferenciar y
• cuantificar poblaciones de linfocitos B y T.
  Estos marcadores convencionales,
• están basados en las características
  específicas de ciertos receptores de
• membrana, presentes en ambas poblaciones de
  linfocitos. Los principales
• marcadores son

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Linfocitos B
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Linfocitos T
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.- Para los linfocitos B inmunoglobulinas de
superficie que pueden ser detectadas con suero
policlonales o Acs. monoclonales marcados con
fluorescencia (isotiocianato de fluoresceína).
En el microscopio de fluorescencia se puede
observar que en la membrana aparece una reacción
fluorescente positiva.

• .- Para los linfocitos T
• Rosetas con los eritrocitos. Los linfocitos T
  presentan la característica de formar Rosetas
  cuando se
• unen a los eritrocitos de carnero.Actualmente se
  usan métodosen los que GRC se tratan con
• neuroaminidasa o AET( 2-aminoethylisothiouronium
  bromide) para aumentar la unión de las cel. T.
• Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el 
  marcaje con naranja de acridina y la posterior
• observación al microscopio de fluorescencia y luz
  ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se
  marcan con la
• naranja de acridina, presentando los linfocitos T
  rosetas mientras que los B se marcan con la
  naranja de
• acridina pero no forman rosetas.

E
Rendimiento gt 95 cel. T, lt 1 cel. B y 2
monocitos Población no T lt 2 cel. T, 40 cel. B
y 60 monocitos
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2.- Antígenos de membrana Expresión diferencial
de marcadores de superficie y disponibilidad de
AcMo con especificidad deseada

•  Técnicas
• .- Lisis Ac/Complemento
• .- Panning
• .- S. Magnética
• .- Análisis por citometría de flujo.
• .- Inmunohistoquímica.  

Separación
Identificación
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• - positiva
• Panning
• - negativa

Rendimiento gt 90 pureza y viabilidad
Ag -
Wysocki y Sato,1978 Mage y col,1977 Engleman y
col,1982 Payne y col, 1981
Placa sensibilizada Ac
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Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados
fisicamente usando Acs acoplados a perlas
magnéticas
Ventajas pureza, reproducibilidad, manejo de
cantidades variables de células ( 106 a 1010
células). Rendimiento gt 98 pureza
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Análisis por citometría de flujo.

• El citómetro de flujo es un aparato que permite
  caracterizar e incluso separar las diferentes
  poblaciones linfocitarias in vitro mediante el
  uso de anticuerpos monoclonales marcados con
  fluoresceína, PE,etc frente a los marcadores de
  superficie específicos de cada subpoblación que
  se desee estudiar.

• Las células, sobre las que se adicionan los
  monoclonales (se pueden valorar varios a la vez)
  frente al marcador objeto de estudio (CD2, CD4,
  CD8, etc.) pasan a través de un haz de un láser
  que detecta su capacidad para dispersar la luz
  (tamaño de las células) y la fluorescencia que
  emiten (tipo de célula). Las mediciones obtenidas
  se indican en porcentajes de cada población.

Costoso... Exacto, rápido y fácil en manos
experimentadas
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Citometría de Flujo
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• Inmunohistoquímica. Utilizando anticuerpos
  monoclonales, marcados con fluorescencia o con
  peroxidasa,  frente a los diferentes linfocitos,
   se puede valorar la situación de estas células
  en cualquier tejido. Incluso utilizando dos
  anticuerpos monoclonales, cada uno frente a una
  población linfocitaria distinta, y cada uno
  marcado con una enzima diferente (doble marcaje)
  (peroxidasa fosfatasa alcalina) se pueden
  estudiar dos poblaciones celulares a la vez en
  cualquier tejido .

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3.- Pruebas funcionales

• Estos métodos de estudio se basan en valorar la
  capacidad que tanto los linfocitos T como los B 
  tienen para reconocer a un antígeno determinado.
  Las técnicas más utilizadas son
•          Estimulación blástica o  Blastogénesis
•          La actividad citotóxica de los
  linfocitos T (CD 8)

La utilización de la transformación linfocitaria,
blastogénesis o proliferación es actualmente una
de las técnicas  más precisas y difundidas para
el estudio de la capacidad de estimulación
específica y no específica de los linfocitos in
vitro. Esta técnica se basa en la capacidad que
los linfocitos tienen para responder frente a un
antígeno (respuesta específica) que por
vacunación o por sufrir una infección, ha
inducido linfocitos memoria.
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Los linfocitos al estar de nuevo en contacto con
el antígeno inducen una proliferación, la cual
puede ser inducida de forma no específica gracias
a la capacidad de los linfocitos de reaccionar
con diferentes tipos de lectinas o mitógenos. Los
mitógenosinducen una estimulación blástica de
tipo inespecífico tanto en los linfocitos B como
en los T.
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• TECNICAS
• a.- Incorporación de 3H dentro del ADN de las
  células.
• b.- FACS ? contenido de ADN-ARN (proliferación de
  células individuales)
• c.- Ensayos colorimétricos MTT
  (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5diphenyltetrazoliu
  m bromide) y SDS

• Funciones efectoras de cel. T . Qué podemos
  medir ?
• Secreción de citoquinas en Sn de cultivo.
• Efectos regulatorios sobre cel. B ( por ej.
  cuantificar niveles de Ig)
• Actividad citotóxica.
• La actividad citotóxica de los linfocitos
  T(CD8)
• La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD
  8) frente a una célula blanco se puede
• estudiar, midiendo la capacidad de destrucción,
  que un determinado número de
• linfocitos T tienen para destruir un determinado
  número de células blanco, al estar
• ambas poblaciones en contacto. Hay varios métodos
  para poder valorar el porcentaje de
• lisis o muerte celular que expresan las células
  blanco, aunque el más utilizado por su
• precisión, sensibilidad y reproducibilidad, es el
  de la liberación de cromo 51 procedente
• de las células blanco.

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•  
• Este método consiste, brevemente, en lo
  siguiente Las células blanco
• (que expresan los antígenos determinados en su
  membrana) son
• marcadas con Cromo 51 y puestas en contacto en
  una proporción
• adecuada con las células efectoras (linfocitos
  T). Tras incubar ambas
• poblaciones celulares conjuntamente por un
  periodo de incubación
• determinado, se centrifugan y seguidamente una
  parte del sobrenadante
• resultante es medido mediante un contador de
  partículas gamma para
• conocer el porcentaje de cromo 51 liberado al
  medio. A mayor cantidad
• de cromo liberado mayor actividad citotóxica.

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Ventajas Especificidad, rapidez y
facilidadDesventajas sensibilidad (10-50 pg
/ml) ltltlt Bioensayo. No diferencia citoquinas
activas de fragmentos inactivos.

• Producción de citoquinas in vitro
• a.- Inmunoensayos.
• b.- Bioensayos

• INMUNOENSAYOS ELISA

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ELISPOT ASSAY
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BIOENSAYOS

• Ensayos muy sensibles ( 1 pg/ml) ? bioactividad y
  potencia.
• TECNICAS
• a.- Proliferación ? Crecimiento cel. Blanco
  susceptibles ( IL-1,2,3,4,5,6,7).
• b.- Citotoxicidad ? Muerte o inhibición del
  crecimiento de cel. Blanco susceptibles ( TNF ?
  L929, IL-1 ? A375).
• c.- Diferenciación de cel. Blanco susceptibles (
  CSF, IL-3 ? crecimiento sobre agar suave INF- ?
  ( expresión de MHC clase II, fagocitosis
  macrófagos).
• Desventajas Dificil de realizar, mayor tiempo(
  dias a semanas) y ltltespecificidad.

Cel. Viables
Multiples Citoquinas compartiendo
actividad Cuidadosos controles