Sin ttulo de diapositiva

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Análisis enzimático

• Métodos de cambio total, de equilibrio (no
  cinéticos)
• Métodos cinéticos enzimáticos

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Métodos de cambio total, equilibrio
o punto final
FUNDAMENTO
La muestra se incuba con el enzima en exceso y
se espera a que la reacción enzimática
finalice. Se evalúa el cambio producido en la
transformación por medio de una especie
indicadora que puede ser
Un substrato

Un producto
Un cofactor
Un
cromógeno Z P Reactivo Z el
equilibrio puede ser desfavorable
Observaciones No se trata de un método
cinético El método puede ser de un solo paso
o utilizar reacciones
acopladas.
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Métodos de equilibrio
(equilibrio favorable)
1 Métodos de un solo paso Especie indicadora
substrato
Ejemplo
02 H2O
uricasa
Ácido úrico ? 292 nm
CO2 H2O2
Alantoina
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Métodos de equilibrio (equilibrio favorable)
Detección de substrato
A 292
90?M
50?M
Absorbancia
30?M
t/min.
Determinación de ácido úrico.
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Métodos de equilibrio (equilibrio favorable)
Especie indicadora Producto
MI
Maleato Fumarato
(? 290 nm)
Ejemplos
POD
H2O2 DH2 2 H2O D
(o-dianisina)
(? 440 nm)
Detección de cofactor
Nitrato reductasa
NO3 - NADH H NO2 -
NAD H2O
Ejemplos
Acetalehido NAD Ácido acético
NADH H
ALDH
(? 340 nm)
6
Métodos de equilibrio (equilibrio favorable)
Detección de NADH (? 340 nm)
NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDO
259
A B S O R B A N C I A
NADH
NAD
340
LONGITUD DE ONDA (nm)
7
(No Transcript)
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
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MÉTODOS QUE USAN REACCIONES ACOPLADAS
Cuando en una reacción enzimática, no existe
ningún tipo de substancia indicadora, se puede
acoplar una segunda reacción que transforme algún
producto o substrato de la primera en una o mas
sustancias indicadoras. Ambas reacciones (
auxiliar e indicadora) se realizan en la
misma mezcla de ensayo. Con estos métodos se
amplía el campo de analítos potenciales.
Se puede abordar el análisis de multicomponentes.
Existen dos tipos de estrategias analíticas
dependiendo de la secuencia utilizada en el
acoplamiento de los dos tipos de reacciones.
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Métodos que usan reacciones acopladas
Reacción auxiliar
aquella en la que se transforma la sustancia
que se quiere determinar.
Reacción indicadora
la que sirve para realizar la medida.
1 Reacción indicadora subsiguiente
Eaux
S1
S2 P1 P2
compuesto a determinar
P3
P4
Eind
P1
S3


2 Reacción indicadora precedente
Eind
B
S2
A

C
compuesto potencialmente medible
Eaux
S1
S2
P1 P2
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Reaciones enzimáticas acopladas
Reacción indicadora subsiguiente La especie
indicadora que se genera en la reacción auxiliar
se mide mediante la reacción indicadora que se
acopla a continuación.
(1)
(2)

• Reacción indicadora precedente
• En la reacción auxiliar interviene el analito que
  reacciona estequiométricamente
• con una sustancia que se produce en la reacción
  indicadora que la precede.
• Solo se usa si el anterior acoplamiento no es
  posible.
• Requieren exceso grande de enzimas (disminuye la
  selectividad del ensayo)

Cuando se usa el acoplamiento (1) se pueden
acoplar mas de un enzima auxiliar ( coste mayor)
con una sola reacción indicadora. También puede
suceder que las reacciones auxiliares no estén
acopladas entre si y den todas ellas el mismo
producto (mezclas de disacáridos que originan
glucosa) La versatilidad de estrategias de
acoplamiento permiten análisis de mezclas
sin ningún tipo de separación.
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Sistemas con reacción indicadora subsiguiente
HK
Ejemplo
Glucosa ATP Glucosa-6-P ADP
(auxiliar)
Glucosa-6-P NADP 6-fosfogluconato
NADPH H
G6PDH
A340
2
HK
1
Incubación muestra con G6PDH
?A
1
1
Adición de HK y reducción de NADP
2
t/min.
Determinación de glucosa mediante acoplamiento
HK-G6PDH
NADP en exceso
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Sistemas con reacción indicadora subsiguiente
Ejemplo determinación de mezclas multicomponentes
Enzima indicadora
Susbtratos a determinar
Glucosa-6-fosfato (G-6-P)
Glucosa-1-fosfato (G-1-P) Glucosa Fructosa F
ructosa-6-fosfato (F-6-P)
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G-6PDH)
Enzimas auxiliares
Fosfoglucomutasa (PGM
Hexoquinasa (HK)
Fosfoglucoisomerasa (PGI)
Fructosa Glucosa
HK3
HK3
G6PDH 1
PGI 4
F-6-P G-6-P
6-fosfogluconato
PGM 2
G-1-P
NADPH H
NADP
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Análisis de mezclas multicomponentes (Sistema
s con reacción indicadora subsiguiente)
La constante de la reacción indicadora ha de ser
muy favorable (muy desplazada hacia
los Productos)
El inverso de la constante de esa reacción ha
de ser superior a las constantes de las
reacciones auxiliares.
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Sistemas con reacción indicadora precedente
Son menos precisos y están sometidos a
fuentes de error importantes. Sólo se han de
usar si no es posible utilizar el sistema
anterior. Requieren elevado consumo de enzima
(Se trabaja con cinéticas muy desfavorables)
La constante de la reacción indicadora ha de
ser pequeña ( desplazamiento hacia reactivos)
La constante de la reacción auxiliar ha de ser
grande ( desplazamiento hacia los productos)
Se miden desplazamientos de equilibrios mas
que cambios de concentración.
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Sistemas con reacción indicadora precedente
Ejemplo Determinación de acetato o
acetilcoenzima A
AK
acetato ATP acetil-P ADP
PTA
acetil-P CoA-SH acetil-CoA PO43-
(auxiliares)
CS
acetil-CoA oxalacetato citrato
CoA-SH
MDH
Malato NAD oxalacetato NADH H
(indicadora)
Enzimas auxiliares Enzima
indicadora Fosfato kinasa (AK)
Malatodeshidrogenasa (MDH) Fosfotranscerilasa
(PTA) Citrato sintetasa (CS)
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Características generales de los métodos
enzimáticos
Métodos de punto final
Son métodos comercializados (kits
enzimáticos) Consumen cantidad apreciable de
enzimas ( coste elevado)
Requieren medidas del blanco de muestra.
Métodos cinéticos
No requieren blancos de referencia Consumen
menos enzima Son mas sensibles Son mas
rápidos Presentan menos interferencias
matriciales ( color, turbidez de muestra..)
Requieren mas rigor en las condiciones
experimentales.
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(No Transcript)
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Especies determinables por su efecto inhibidor
Inhibidor
Enzima Al(III), Pb(II),Fe(II),Fe(II
I), Cd(II), Hg(II), Ni(II), Cu(II)
Ag(I) Be(II), Bi(III), Al(III), Zn(II)
Fosfatasa alcalina Hg(II), Ag(I), Pb(II)
Glucosa oxidasa Zn(II),
Pb(II),Mn(II),Hg(II), Ag(I) Ureasa Co(II),
Fe(II),Fe(III), Mn(II), Pb(II) Peroxidasa
CN-
Hialuronidasa S2-, NH2OH

Peroxidasa p-aminocloromercuribenzoato
Xantina oxidasa Ácido ascórbico
Catalasa Triton X-10
Lipasa Penicilina
D- alanina
carboxipeptidasa Retinol
?-Glucuronidasa DDT

Anhidrasa carbónica Plaguicidas organofosforados
Colinesterasa
Isocitrato deshidrogenasa
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Cationes determinables por su efecto activador
Activador
Enzima Ba 2
Fosfatasa Alcalina Ca 2
Fosfatasa Alcalina
Co 2
Isocitrato deshidrogenasa Cu 2
Aminopeptidasa K

Fosfofructoquinasa
Piruvato quinasa
Mg 2
Acetato quinasa
Creatina fosfoquinasa

Hexoquinasa
Piruvato deshidrogenasa Mn 2
Arginasa

Isocitrato deshidrogenasa Zn 2
Aminopeptidasa
Malato
deshidrogenasa
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Ensayos catalíticos
El analito (traza) se incorpora como catalizador
de una reacción acoplada de orden cero,
regenerándose enzimáticamente (concentración
constante)
H
Se construyen fácilmente calibrados de NADH
midiendo la velocidad de producción constante de
citocromo reducido
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Métodos basados en reacciones de orden 1
Ejemplo Determinación de substratos
v max KM


Se usan enzimas con KM grandes y (o)
inhibidores que los facilitan.
v
S
V es proporcional a S
Con tal que Slt0.05 KM
Absorbancia
Estos métodos se pueden aplicar a reacciones
rever- sibles y acopladas. Tambíén se aplican
a sistemas bisustrato
Las medidas de v son más difíciles y
requieren fijar los tiempos con exactitud
tiempo
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Métodos basados en reacciones de orden 1
Ejemplos
Determinación de glucosa ( tiempo fijo)
GOD
?-D-glucopiranosa O2
?-D-glucolactona H2O2
POD
2H2O2 Fenol 4-aminofenazona
POD
H2O
4-(4-benzoquinona monoimino)-fenazona
Se mide el cambio de absorbancia en tiempos de 35
y 125 s desde el inicio de la reacción.
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Métodos basados en reacciones de orden 1
Ejemplos
Determinación de glicerol y triglicéridos
(tiempo fijo)
GK
glicerol-3-P ADP
glicerol
ATP
PK
ADP fosfoenolpiruvato piruvato ATP
LDH
Piruvato
NADH
H lactato NAD
previa hidrólisis enzimática y usando
inhibidores
El ensayo se realiza en muestras reales
(suero)
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CONCLUSIONES
Los métodos enzimáticos por su rapidez y
especificidad son imprescindibles en los
laboratorios clínicos. Son perfectamente
automatizables y permiten análisis
secuenciales de multicomponentes ( sin
separaciones previas). Adquieren gran
importancia en el control analítico de
alimentos ( adulteraciones), caso de alcoholes
ácidos y bases orgánicas, aminoácidos..etc. En
ocasiones también del control ambiental.
(inhibición enzimática) El avance de
las técnicas de inmobilización de enzimas,
potencia la investigación actual de estos
métodos ( sensores enzimáticos).