Diapositiva 1

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MÓDULO OPTATIVO

• Testosterone reduces macrophage expression of
  Toll- like receptor 4 in the mouse, a trigger for
  inflammation and innate immunity

Dra. Cristina MALDONADO
Centro de Microscopía Electrónica Facultad de
Ciencias Médicas Universidad Nacional de Córdoba
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? El Sexo es un factor que contribuye a la
incidencia y progresión de desórdenes que se
asocien con una desregulación del sistema inmune.
? Más recientemente se ha informado que también
tendría importancia en la susceptibilidad a
enfermedades infecciosas.
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(No Transcript)
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Evidencias del dimorfismo sexual en la respuesta
inmune
1- Las mujeres producen una vigorosa inmunidad
humoral y celular.
2- Son más resistentes a las infecciones
bacterianas.
3- En mujeres se observa mayor prevalencia de
enfermedades autoinmunes como la artritis
reumatoideas, lupus, tiroiditis de
Hashimoto, la enfermedad de Graves, esclerosis
múltiple.
4- Su expresión se exacerban en el embarazo y/o
ciclo menstrual.
5- A nivel experimental se concluyó que cambios
en los niveles de las hormonas esteroideas
pueden modular dichas enfermedades
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Las enfermedades autoinmunes son más frecuentes
en el sexo femenino
Tabla 1 prevalencia de enfermedades autoinmunes
según el sexo
Enfermedad mujereshombres
Artritis Reumatoidea 21 Lupus eritematoso
sistémico 91 Cirrosis biliar
primaria 91 Enfermedad de Graves 51 Tiroidi
tis de Hashimoto 401
Tomado de Olsen and Kovacs, Endocrine Reviews
1996 17369-84
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Hormonas sexuales e inmunidad
Sex hormones and the immune response in humans
Bouman A, MJ Heineman and MM Faas. Human
Reproduction Update, 2005 11411-423.
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Dimorfismo sexual en la sensibilidad a infecciones
La testosterona, administrada en forma exógena,
incrementa la susceptibilidad de la hembra a la
infección con Micobacterium marinum , mientras
que la castración atenúa la sensibilidad de los
machos
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La INMUNIDAD INNATA comprende mecanismos no
específicos dirigidos contra el antígeno
agresor, de actuación inmediata.
Células inmunocompetentes
Linfocitos B
Linfocitos Th
Linfocitos B
Linfocitos Tc
Células NK
Neutrófilo
Macrófago
Basófilos
Mastocitos
Macrófago
Dendrítica
Célula plasmática
Dendrítica
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patógeno
Receptor Toll-like
Li T helper CD4
Célula presentadora de antígeno
MACRÓFAGO
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Testosterona reduce la activación inducida por
LPS de la transcripción de citoquinas
proinflamatorias y la respuesta inmune de
macrófagos aislados.
El objetivo de este trabajo fue determinar de
qué manera la Testosterona altera la
respuesta inmune de los macrófagos.
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TRATAMIENTOS IN VITRO
Macrófagos línea celular RAW 264.7 proveniente
de ratón, derivadas de células CRL-2278 (ATCC,
USA). Fueron crecidas en medio RPMI 1640
conteniendo suero al 2. A fin de minimizar la
exposición a hormonas reproductivas.
Efecto de la Testosterona en la expresión de TLR4
Tratamiento propionato de testosterona 1-1000
nM
Animales ratas machos C57BL/6 (Jackson
Laboratory, USA), de 8 semanas de edad.
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TRATAMIENTOS IN VIVO
I- Castración y reposición de la
testosterona 1º Grupo Bajo anestesia
(Isoflurane inhalada) se procedió a realizar una
incisión escrotal bilateral y se removieron los
testículos. 2º Grupo fueron sham operados.
Ambos grupos se los dejó recuperar por 5 semanas.
3º Grupo una vez castrados, los animales
recibieron inyecciones Subcutáneas de propionato
de testosterona en aceite de girasol (5mg/Kg)
cada tres días por cinco semanas.
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MODELOS EXPERIMENTALES IN VIVO
I- Castración y reposición de la testosterona
?Aislamiento de macrófagos peritoneales QUÉ
ESTUDIA?? 1º- cada animal recibió una inyección
intraperitoneal de 200 ul de Adyuvante de
Freunds incompleto. 2º- Tres días después, la
cavidad peritoneal se lavó con medio RPMI 1640
(7 x 1.5 ml por animal) conteniendo 10 de Suero
Fetal Bovino a fin de remover los macrófagos.
3º- Las células se lavaron con RPMI 1640, y los
macrófagos adherentes se cultivan en el mismo
medio conteniendo 2 de Suero Fetal Bovino y
Gentamicina.
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TRATAMIENTOS IN VIVO
II- Tratamiento con endotoxina Los tres grupos
anteriores recibieron inyecciones
intraperi- Oneales (ip) de LPS (5 mg/Kg) aislada
de E. coli.
Evaluación del estado de los animales a las 24
horas de tratamiento
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METODOLOGÍAS
Inmunofluorescencia para TLR4/MD-2
Anticuerpo anti TLR4/MD2 (eBioscience) se
determinó la presencia de TLR4 asociado con
MD-2, la molécula permisiva. Reveladomarcado
con phy6coerythrin (PE-conjugated antibody, 45
minutos a 4ºC, FACS.
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METODOLOGÍAS
Cuantificación de TNF e Interleukina 6
ELISA para IL6 se usó un anticuerpo de captura
anti IL6 (PharMingen) y un anticuerpo biotinado
anti-IL6 de ratón. El revelado final con
streptavidina-HRP (BD PharMingen). El menor nivel
de detección fue de 4 pg/ml.
ELISA para TNF kit comercial (RD System). El
menor nivel de detección es 16 pg/ml
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RESULTADOS
La testosterona disminuye la expresión de TLR4 en
células RAW 264,7
24 hr Testosterone 1?M
Figure 1 CITOMETRÍA DE FLUJO
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Testosterona disminuye la sensibilidad de los
macrófagos a LPS, ligando específico de TLR4?
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Niveles de TNF por ELISA inducidos por LPS
Pretratamiento in vitro con Testosterona
P lt 0,05
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Testosterona disminuye la expresión de TLR4 en
superficie, en macrófagos aislados de animales
desprovistos de andrógenos endógenos
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Testosterona disminuye la expresión de Tnf
inducida por LPS (250 ng/ml por 12 horas) en los
macrófagos aislados de animales desprovistos de
andrógenos endógenos
.
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Testosterona endógena disminuye la expresión
superficial de TLR4 en monocitos in vivo.
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En los animales castrados, la supresión de
testosterona endógena eleva la susceptibilidad
al shock endotóxico in vivo.
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PRINCIPALES CONCLUSIONES

• Testosterona induce disminución significativa de
  la expresión superficial
• de TLR4 en macrófagos cultivados en ausencia de
  andrógenos o provenientes
• de animales castrados.

• Testosterona disminuye la sensibilidad para
  responder a LPS, ligando específico
• de TLR4.

- El déficit de testosterona determina mayor
susceptibilidad al shock endotóxico
- Estos efectos serían parte de los efectos
inmunosupresivos de la testosterona
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IMPLICANCIAS Y RELACIONES CON ANTECEDENTES
Estos resultados permiten explicar el efecto de
testosterona disminuyendo la producción de
respuesta inflamatoria inducida por LPS.
También permiten explicar la mayor incidencia y
severidad de la sepsis Bacteriana observada en
machos que los vuelve más sensibles al shock
séptico que las hembras
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MUCHAS GRACIAS