Cultivo de Tejidos de Clulas Animales II

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Cultivo de Tejidos de Células Animales II

• Dr. Rolando García González
• Universidad de Talca

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Cultivos celulares primarios Cultivos celulares
obtenidos a partir de tejidos normales o
patológicos mediante disgregación (mecánica o
enzimática) o explantes de tejidos u órganos.
-Poder limitado de proliferación celular. -Poder
limitado de expansión (número limitado de
generaciones).
Línea Celular Primaria
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Cultivos celulares estables Cultivos celulares
obtenidos a partir de líneas celulares primarias,
que hayan sufrido un fenómeno de
transformación (natural o inducida).

• Poder ilimitado de proliferación celular.
• Poder ilimitado de expansión (número ilimitado
  de generaciones).
• Inmortalización celular.

Línea Celular Estable (o Continua)
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Ciclos o etapas del cultivo celular
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Línea celular continua o estable
Normal human glial cell line
Continuous cell line from human metastatic
melanoma
La capacidad de crecimiento continuo de algunas
líneas celulares refleja su habilidad de
variación genética. Probablemente, relacionada
con el aumento en la expresión del gen de la
telomerasa y las mutaciones nivel de
cromosómico. Freshney, Culture of animal cells,
5th edit, p. 41.
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• Diferenciación
• Adquisición de las propiedades diferenciales de
  un tipo celular en cultivo (Ej líneas
  progenitoras de la sangre).
• Desdiferenciación
• Indica la pérdida, de forma irreversible, de las
  propiedades diferenciales de un tipo celular en
  cultivo (Ej hepatocitos/ almacenar glucógeno.
• Desadaptación
• Implica que las características especializadas de
  determinados tipos celulares se encuentran
  reguladas por factores que pueden introducirse de
  forma controlada en los cultivos celulares (Ej
  células epiteliales de la glándula mamaria y
  producción de proteínas lácteas).

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Características fisiológicas de los cultivos
celulares
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Procedimientos para establecer cultivos primarios
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Digestión enzimática de los tejidos. Tipos de
enzimas.

• Colagenasa (Clostridium hystoliticum)
  (clostridiumpeptidase A). Hidroliza el colágeno
  en su conformación de triple hélice liberando
  fragmentos cortos, gelatina.
• Las preparaciones comerciales contienen otras
  proteasas, polisacaridasas y lipasas. Se definen
  cuatro tipos
• Tipo I. Todo tipo de actividades. Recomendada
  adrenales, hígado, adiposo.
• Tipo II. Con una actividad clostridiopeptidasa
  superior corazón, músculo, cartílago, tiroides
  e hígado.
• Tipo III. Baja actividad proteolítica. Células de
  mamífero en general.
• Tipo IV. Baja actividad tripsina. Recomendada en
  aislamiento de islotes donde es crítico el
  mantenimiento de la integridad de los receptores.
• Tripsina. Serina proteasa pancreática, corta
  enlaces peptídicos en que estén implicados los AA
  básicos arginina y lisina. Se emplea como nombre
  comercial de un preparado (Trypsin) de páncreas
  porcino (con actividades proteasa,
  polisacaridasa, nucleasa y lipasa. En
  laboratorios de cultivo se emplea tripsina
  purificada.
• Elastasa, Serina proteasa pancreática, corta
  enlaces peptídicos adyacentes a AA neutros.
  Capacidad degradar elastina. Empleada en la
  disociación de tejidos conectivos, usualmente
  junto con tripsina o colagenasa.

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• Elastasa, Serina proteasa pancreática, corta
  enlaces peptídicos adyacentes a AA neutros.
  Capacidad degradar elastina. Empleada en la
  disociación de tejidos conectivos, usualmente
  junto con tripsina o colagenasa.
• Hialuronidasa. Polisacaridasa. Secuencia de corte
  característica de hialurónico y condroitin
  sulfato. Empleada en disociación de tejidos.
• Papaína. Sulfihidril proteasa de Carica papaya.
  Amplia especificidad, más activa que tripsina.
  Recomendada para aislamiento de neuronas pues
  aparentemente daña menos que el tratamiento con
  tripsina.
• DNAsa I. Como consecuencia de la lisis celular en
  el aislamiento se libera DNA que incrementa la
  viscosidad, dificultando la manipulación.
• Pronasa. Enzima bacteriana, de Streptomices
  frisens. Alternativa a tripsina en la disociación
  celular en cultivo. Habitualmente junto con
  colagenasa.
• Dispasa. Enzima bacteriana de Bacillus polymixa.
  Metaloenzima que requiere Ca2 para su actividad.
  Usada en tejidos con bajo contenido de ácido
  hialurónico.

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• Pronasa. Enzima bacteriana, de Streptomices
  frisens. Alternativa a tripsina en la disociación
  celular en cultivo. Habitualmente junto con
  colagenasa.
• Dispasa. Enzima bacteriana de Bacillus polymixa.
  Metaloenzima que requiere Ca2 para su actividad.
  Usada en tejidos con bajo contenido de ácido
  hialurónico.
• EDTA. Ácido etilendiaminotetraacético. A 0.02
  en tampón fosfato salino sin Ca2 ni Mg2 se
  emplea junto con la tripsina para aumentar la
  disociación celular.
• Inhibidor de tripsina (soja). Inactiva la
  actividad proteolítica de la tripsina, pero no la
  esterolítica ni tampoco afecta a la elastasa.

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Escala de intensidad digestiva de las enzimas
utilizadas en Cultivo Celular.
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Métodos de separación celular

• Sedimentación
• Proceso de separación a partir de gradiente los
  coeficientes de sedimentación de los diferentes
  tipos celulares.
• Bajo costo.
• Time consuming.
• Afecta viabilidad celular.

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• Centrifugación
• Permite separar con eficiencias células de
  diferentes coeficientes de sedimentación.
• Se utilizan gradientes para separa tipos
  celulares.

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• Selector celular activado por Fluorescencia
  (FACS. Fluorescence activated cell sorter).
• Separación de células en función de propiedades
  de tamaño, complejidad celular o marcadores.
• Habitualmente mediante marcaje fluorescente.

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• Cuerpos magnéticos (Magnetic beads)
• Aisla células marcadas con un anticuerpo mediante
  un segundo anticuerpo unido a una bola magnética
  que es retenida mediante un campo magnético o una
  columna de intercambio.
• Elevada eficiencia y especificidad.
• El número máximo a separar depende del tipo
  celular (106-110).

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MACS- Selección Positiva
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MACS- Selección Positiva
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MACS- Estrategia de eliminación (o arresto,
depletion)
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MACS- Estrategia de eliminación (o arresto,
depletion) Selección positiva
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MACS- Estrategia de multiselección
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• Muerte selectiva. Anticuerpos contra marcadores
  de superficie de la población no deseada,
  seguidos de complemento...
• Clonaje. Para conseguir una población
  homogénea... Aislamiento mediante dilución...

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Ejemplos de cultivos celulares
Fibloblastos esclerales humanos (explante
escleral)
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Ejemplos de cultivos celulares
Epitelio conjuntival humano (explante
conjuntival)
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Protocolo general
Epitelio conjuntival humano (explante
conjuntival)
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(No Transcript)
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Aislamiento de células endoteliales de aorta
bovina
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Aislamiento de células endoteliales de aorta
bovina
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Aislamiento de células endoteliales de cordón
umbilical humano (HUVEC)
Universidad de Barcelona
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Protocolo de aislamiento de células endoteliales
del cordón umbilical humano Laboratorio
CelltecUB, DBC, UB
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(No Transcript)