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Metodos de mejoramiento genetico de
microorganismos de interes industrial

• Selección de microorganismos de la naturaleza
• Selección directa de secuencias geneticas de
  interes del medio ambiente (pos-genomica)
• MUTACION CON AGENTES MUTAGENICOS Y SELECCIÓN DE
  MUTANTES (al azar, sitio dirigida, Basada en
  propiedades metabolicas)
• HIBRIDIZACION, RECOMBINACION Y SELECCIÓN DE
  RECOMBINANTES
• TRANSFORMACION
• CONJUGACION
• TRANSDUCCION
• CLONADO y EXPRESION DE GENES

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MUTACIONES CAUSADAS POR LOS MECANISMOS DE
REPARACION

• Son sistemas inducibles que se activan frente al
  daño en el DNA (aprox 1000 bp) o cuando se inhibe
  la replicacion
• 1- Respuesta S.O.S Mediada por el regulon Rec A
  - Lex A
• Lex
  A activo (-)recA,sulA, uvr ABD,
  
• RecA ssbDNA RecA
• Lex
  A inactivo
• 2- Reparacion de zonas amplias de DNA doble
  cadena (recA lexA recN)

umuDC, polB
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(No Transcript)
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(No Transcript)
5
(No Transcript)
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Mutagenesis Dirigida

• Procedimientos para introducir mutaciones en
  sitios precisos de un gen
• 1- Mediante deleciones generadas con una enzima
  de restriccion y luego
• Inserciones de nucleotidos modificados mediante
  conectores que reconocen los sitios de clivaje de
  la enzima (in vitro)
• 3- Empleando transposones flanqueados con
  secuencias que hibridizan donde se desea la
  recombinacion y luego seleccionando por el
  fenotipo negativo (in vivo)
• 4- Empleando oligonucleotidos sinteticos
  modificados. Hay varias estrategias posibles
• a- Obtenidos ïn vitro por sintesis a partir de
  amplificar con el fago M13 (simple cadena)

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(No Transcript)
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b- Obtenidos por PCR y clonados en plasmidos
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MARCADORES GENETICOS PARA HUESPEDES Es
importante conocer las caracteristicas que tienen
ciertas mutaciones y genes utiles en los
experimentos de clonado ya que pueden favorecer o
impidir el funcionamiento de los mecanismos de
replicacion, reparacion y/o restriccion del DNA y
y modificar la expresion de las secuencias
mutacion recA - genes recBC, recF mutacion
sup E , sup F gen dam gen hsd gen
lacI mutacion ts
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OTROS METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN
BACTERIAS Y EUCARIOTAS INFERIORES 1-
Conjugacion  Es la transferencia de un fragmento
de DNA por contacto directo entre un donante a un
receptor mediado por un plasmido CONJUGATIVO (F)
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Significance in Gram bacteria Antibiotic
resistance Rapid spread Significance in Gram
bacteria Production of adhesive material by
donor cells
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2- Transduccion  Transferencia de DNA de una
celula donante por medio de fagos. El fragmento
puede Integrarse por recombinacion sitio
especifica ( genes att e hin ) Ej.
Patogenicidad Degradarse (si no se integra)
Si se trata de un plasmido (linealizado) puede
recircularse y replicarse en forma autonoma. 3-
Transformacion  transferencia de DNA desnudo por
celulas competentes. El DNA exogeno puede
Integrarse al cromosoma (recombinacion)
Mantenerse como plasmido Ser degradado
(nucleasas) Ej. adquisicion de caracteres
diversos en la naturaleza Aumento de la
fijacion de nitrogeno (simbiosis de Rhizobium con
leguminosas)
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• 4- Elementos Geneticos Transponibles Es una
  Recombinacion sin homologia mediada por
  transposones
• Trasposon elemento genetico movil que no puede
  replicarse en forma autonoma y que se inserta en
  forma aleatoria
• La transposicion involucra una recombinacion
  sitio especifica por medio de una
• enzima (Transposase) y puede acompañarse
  con duplicacion
• Los transposones pueden pertenecer a 3
  categorias
• Secuencias de insercion
• Transposones compuestos
• Transposones no compuestos

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(No Transcript)
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Otros metodos geneticos para el mejoramiento de
microorganismos de interes industrial
Sexual Intercambio de fragmentos homologos por
cross- over durante el proceso de meiosis
Recombinación
Parasexual Intercambio de fragmentos de
cromatides o cromosomas enteros por cross-over
mitotico
Intercambio al azar de material genetico
favorecido por la eliminacion de pared
celular Se aplica a bacterias, hongos y
levaduras.
Fusion de Protoplastos
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(No Transcript)
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USO DEL CICLO SEXUAL PARA LA RECOMBINACION
GENETICA EN HONGOS y LEVADURAS
Reproduccion asexual
Interaccion de celulas de distinto mating type (a
o ?)
mitosis
haploide
ascosporas
Aislamiento y seleccion
Fusion celular
asco
meiosis
Reproduccion asexual
Ciclo biologico de Saccharomyces cerevisae
mitosis
diploide
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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• Para forzar la fusion nuclear y la formacion de
  heterocariones puede emplearse
• Selección nutricional (parentales auxotrofos que
  se cultivan en un medio minimo forzandose la
  recombinacion)eliminar determinantes de genero y
  especie (pared) y forzar la fusion por
• Metodo quimico o fisico (FUSION DE PROTOPLASTOS
  / ELECTROFUSION)
• Forzar la recombinacion con radiaciones
  ionizantes o mutagenos (fluoruracilo)

• METODOS DE FUSION CELULAR  ELECTROFUSION Y
  FUSION DE PROTOPLASTOS
• 1 - Obtencion de protoplastos
• bacterias gram positivas  lisozima o
  antibioticos estabilizador osmotico.
• bacterias gram negativas lisozima EDTA
  estabilizador osmotico
• levaduras y hongos  distintas enzimas 
  glucanasas, sulfatasas, etc

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• 2- Fusion celular
• metodo quimico (PEG Ca 2)  solo para
  protoplastos
• metodo electrico (electroforesis
  electroporacion) que provoca agregacion y luego
  ruptura reversible de la membrana con formacion
  de heterocariones. Para celulas enteras o
  protoplastos.
• 3- Regeneracion de la pared (cultivo en medios
  gelificados)
• 4 - Selección de recombinantes
• por morfologia, contenido de DNA, marcadores
  mitocondriales de resistencia, mutantes
  mitocondriales (petite), niveles de produccion,

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(No Transcript)
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• Ventajas y usos
• Aumentar la frecuencia de formacion de
  heterocariones
• Aumentar la frecuencia de recombinacion
• Puede emplearse para organismos que no conjugan o
  transforman
• Evitan restricciones a la hibridizacion por
  diferencias de sexo o compatibilidad
• Puede emplearse en cepas altamente mutadas y con
  baja viabilidad.
• Limitaciones
• Estabilidad de los recombinantes
• Regeneracion de pared
• Dificil induccion en cepas muy mutadas
• Dificil de aplicar sobre caracteres que requieran
  la expresion de multiples alelos (ej. Nodulacion,
  degradacion de ligninas, etc)