CITOMETRIA DE FLUJO

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CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunologia Curso 2008
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SISTEMA FLUÍDICO COMPONENTES DEL EQUIPO
SISTEMA ÓPTICO SISTEMA
ELECTRÓNICO
Citometría de Flujo
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Citometría de Flujo
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PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS

• El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o
  FSC)
• La complejidad interna o granularidad relativa
  (Side Scatter o SSC)
• Intensidades relativas de emisión de
  fluorescencia
• ( FL1, FL2, FL3 ,FL4..etc..)

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FORWARD SCATER LUZ DIFRACTADA - SE
RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES
-SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL
LASER SIDE SCATER LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA
-SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA
DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD -SE
DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL
LASER
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• MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS
  FLUORESCENTES
• Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas
  monoclonales contra antígenos de la supercicie de
  las celulas, marcadas con colorantes
  fluorescentes.
• Control negativo Anticuerpo del mismo isotipo
  marcado con el mismo fluorocromo pero que no
  reconoce ninguna de las moléculas de la
  superficie.
• Control negativo células que no fueron marcadas
  para determinar autofluorescencia.
• Control positivo células normales, células de
  líneas celulares.

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Fluorocromos utilizados
FL1
FL2
FL4
FL3
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ANALISIS DE DATOS
Los datos colectados se pueden observar de 2
maneras 1) Histograma
Eventos medidos
FLUORESCENCIA
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HISTOGRAMA
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Intensidad de fluorescencia y sitios de unión
FITC
FITC
FITC
Número de eventos
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Intensidad de fluorescencia FITC
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Los datos colectados se pueden observar de 2
maneras 2) Dot-plot
Citometría de Flujo
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Analisis de datos
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
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Elijo un gate Ej. linfocitos
CD3- CD4 en sangre total
CD3 CD4 en gate de linfocitos
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Expresión de Resultados

• Datos porcentuales
• Datos absolutos Partículas de cuantificación
• Datos estadísticos

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Separación de células usando citometría de
flujo (Cell sorting) -El citómetro permite
separar físicamente, poblaciones de células -Se
puede realizar en condiciones de esterilidad.
Citometría de Flujo
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Determinación de citoquinas intracelulares por
citometría
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(No Transcript)
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DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE
FLUJO
TUNEL Determina ADN fragmentado, incorporando a
los extremos de ADN 12-dUTP-FITC
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DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE
FLUJO
TUNEL Determina ADN fragmentado, incorporando a
los extremos de ADN 12-dUTP-FITC
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DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE
FLUJO
ANEXINA V
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DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE
FLUJO
IODURO DE PROPIDIO
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PROLIFERACION CELULAR CFSE

• Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester
  (CFSE)
• - Sonda fluorescente que se une a proteínas
  intracelulares y que se reparte por igual entre
  las células hijas

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Después del cultivo
Basal
CFSE
Fluorescencia / célula
X
X / 2
X / 4
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Cytometric bead arrays (CBA)
Varios analitos
Multiplex ensayo por CF
Citoquinas Determinación de citoquinas
secretadas por citometría
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CBA para citoquinas inflamatorias
IL-6 IL-10 MCP-1 IFN-g TNF-a IL-12
PBS
CBE
FL-3
FL-3
FL-2
FL-2
FL-2 Da cuenta de la concentración de la
citoquina. FL-3 Da cuenta de las diferentes
citoquinas.
Citoquinas Determinación de citoquinas
secretadas por citometría