Tcnicas para Evaluar Inmunidad Viral

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Técnicas para Evaluar Inmunidad Viral

• Inmunología Aplicada 1065
• Formación de profesores 2005 Carolina Hernández
• Supervisado por MD Lastra

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Radioinmunoensayo (RIA)

• Técnica muy sensible basada en la competencia de
  unión al anticuerpo específico entre la sustancia
  a cuantificar y cantidades conocidas de la misma
  sustancia marcada con un isótopo. A mayor
  antígeno a cuantificar, menor será el antígeno
  marcado unido al anticuerpo y viceversa.

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Enzimoinmunoanálisis (EIA)

• Los EIA para la detección de antígeno se basan
  habitualmente en la captura del antígeno por
  anticuerpos específicos unidos a una fase sólida,
  en general, un pocillo de una microplaca o una
  esfera de plástico. El antigeno presente en la
  muestra se combina con el anticuerpo fijado. El
  Ag se detecta con otro anticuerpo específico
  conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato
  para la enzima y se mide la intensidad de color.

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Enzimoinmunoanálisis Indirecto (EIA)

• Se han aplicado de manera amplia en el
  diagnóstico de anticuerpos virales. Los antígenos
  virales se inmovilizan sobre una fase sólida
  (policubetas), se agregan los sueros en estudio,
  se incuban, se lavan y se revela la reacción
  Ag-Ac por el agregado de una Ig antiespecie
  conjugada con una enzima seguida de un sustrato
  apropiado para esta.

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(No Transcript)
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ELISA

• Permite identificar inmunocomplejos por medio de
  enzimas unidas al antígeno o anticuerpo, estando
  uno de ellos adsorbido a un soporte sólido (placa
  de poliestireno). La reacción antígeno-anticuerpo
  se detecta mediante la utilización de un marcador
  que es una enzima conjugada químicamente al
  antígeno o anticuerpo (peroxidasa, fosfatasa), se
  añade un sustrato al cuál la enzima convierte de
  incoloro a un producto coloreado.

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(No Transcript)
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ELISPOT

• Prueba diseñada originalmente para la detección
  de células B secretoras de anticuerpos antígeno
  específicos.
• Se ha adaptado para la detección de células
  secretoras de citocinas específicas u otros
  antígenos.
• Incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase
  sólida ELISA.
• Es un método sensible y selectivo para el estudio
  de citocinas, no requiere estimulación previa
  para reflejar la situación in vivo.

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ELISPOT

• Se puede utilizar para cuantificar y monitorear
  respuesta de células T con frecuencias del orden
  de 1 en 100,00, así como células que secreten
  menos de 100 moléculas de citocina por segundo.
• El IFN-? secretado por las células en cultivo, es
  capturado en las inmediaciones de la células por
  un anticuerpo específico anti- IFN-? adsorbido en
  el fondo del pozo.

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ELISPOT

• Las células se retiran mediante lavados sucesivos
  y se adiciona un segundo anticuerpo específico
  anti-IFN-? marcado con una enzima, el cuál va a
  adherirse al interferón inmovilizado por el
  primer anticuerpo, al adicionar el sustrato de la
  enzima se forma un producto colorido insoluble
  que permite ver el sitio en donde se encontraba
  la célula secretora de IFN-? como una mancha de
  color.

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(No Transcript)
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Inmunofluorescencia

• Es una técnica histoquímica o citoquímica, útil
  para detectar y localizar antígenos en células o
  tejidos. Se utiliza un anticuerpo específico
  conjugado con un compuesto fluorescente dando
  como resultado un marcador sensible contra el
  antígeno.
• Inmunofluorescencia directa (ID). El anticuerpo
  conjugado se añade directamente a la sección de
  tejido o suspensión de células viables.

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Inmunofluorescencia Indirecta

• Se basa en la unión de anticuerpos antivirales a
  los antigenos virales expresados en la superficie
  y el citoplasma de células infectadas (fijadas
  en un portaobjetos). Útil para la determinación
  de anticuerpos antivirales en el suero del
  paciente. Se incuba el suero del paciente con las
  células infectadas y se agrega un anticuerpo
  anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de
  fluoresceína.

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Inmunofluorescencia

• Puede usarse para detectar el virus de la
  influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y
  Adenovirus entre otros

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Virus de la influenza
La presencia de anticuerpos en el citoplasma y
superficie de las células infectadas
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Aglutinación en látex

• La aglutinación de las partículas de látex
  recubiertas por un Ag específico permite la
  detección de Ac libres específicos para el Ag
• Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la
  cantidad y especificidad de la reacción se evalúa
  por los cambios físicos inducidos tras la unión
  del anticuerpo específico con su antígeno
  correspondiente para formar inmunocomplejos.

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Hemaglutinación

• Ciertos virus (influenza, parainfluenza y
  togavirus) producen antígenos que logran
  acoplarse de manera espontánea a los eritrocitos
  y forman reactivos estables para la detección de
  anticuerpos.
• Esta reacción puede inhibirse usando un
  anticuerpo específico antiviral. De esta manera
  la hemaglutinación puede usarse para cuantificar
  el virus y el título de anticuerpos contra el
  virus hemaglutinante.

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Western Blot (WB)

• Con el uso combinado de electroforésis y ELISA
  puede determinarse la respuesta a una diversidad
  de proteínas específicas a patógenos.
• Este procedimiento proporciona un medio
  específico para identificar reactividad de
  anticuerpos.

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Western Blot (WB)

• Se basa en la separación de los antígenos virales
  mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE
  (lo cual proporciona una carga negativa a la
  proteínas).
• Las proteínas virales son sometidas a una
  electroforesis en geles de poliacrilamida. Como
  las proteínas están cargadas negativamente se
  separan con base a su peso molecular (las más
  grandes permanecen en la parte superior del gel y
  las menores migran hacia la base).

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Western Blot (WB)

• Las proteínas se transfieren a un soporte sólido
  (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una
  copia exacta del patrón del gel en la matriz.
• La identificación de las proteínas a estudiar se
  realiza usando un ELISA indirecto. Las reacciones
  se leen como positivas cuando una línea de
  precipitación o color se forma en el peso
  molecular correcto para una proteína particular.

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