Como obtener un clon de un gen especfico

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Como obtener un clon de un gen específico
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Temas

• El problema de la selección
• Selección Directa
• Identificación de un clon en una genoteca
• Métodos diversos de identificación de un clon en
  una genoteca

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El problema de la selección
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Selección Directa

• Solo los clones que contienen el gen deseado
  pueden crecer en condiciones selectivas.
• El gen deseado tiene que expresarse bien en el
  hospedador, y debe también codificar una función
  seleccionable.
• Por ejemplo, resistencia a un antibiótico,
  capacidad para hidrolizar un sustrato específico,
  etc.

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El rescate de funciones o marcadores

• Consiste en seleccionar clones que son capaces de
  complementar un defecto en la bacteria
  hospedador.
• De este modo, la presencia del gen deseado puede
  convertirse en un factor selectivo.
• Sirve para extender el rango de funciones que
  pueden utilizarse para seleccionar un clon
  directamente.
• Tiene limitaciones 1) debe de existir un mutante
  de la función deseada. 2) Tiene que haber un
  medio en el que se pueda seleccionar.

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Identificación de un clon en una genoteca

• Consiste en encontrar una técnica que permita
  distinguir el clon deseado de los demás.
• Implica examinar absolutamente todos los clones.
  Esto conlleva una serie importante de
  consideraciones
• Puesto que algunas genotecas pueden ser muy
  grandes, conviene reducir la ventana de búsqueda
  dentro de una genoteca.
• Algunos genes se expresan en algunos tejidos. Por
  tanto, una segunda genoteca basada en cDNA de un
  tejido puede facilitar la búsqueda.
• Algunos genes se expresan en algunos momentos.
  Por tanto, una tercera genoteca basada en cDNA de
  un tejido en el momento adecuado, puede facilitar
  la búsqueda aun mas.

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Metodos de Identificación de un Gen

• Métodos de Hibridación (DNA y RNA)
• Métodos de reconocimiento de productos de
  traducción (Inmunodetección).

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Métodos de Hibridación

• Cadenas complementarias de ácidos nucléicos
  pueden unirse o hibridarse.
• Si se dispone de una parte de la secuencia del
  gen deseado, se puede generar una sonda marcada
  que tenga esa secuencia.
• A continuación, el DNA de los clones debe de ser
  desnaturalizado y fijado a una membrana.
• A continuación, es incubado en presencia de la
  sonda, para que hibride.
• Finalmente, la membrana se revela, mostrando
  aquellos clones donde se ha hibridado la sonda

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Construcción de una sonda

• A partir de DNA el fragmento se marca con DNA
  radiactivo, por los metodos de rellenado con Pol
  I o relleno de extremos cohesivos con el
  fragmento Klenow.
• También se puede hacer con iniciadores al azar
  (pequeños fragmentos de 6 nucleótidos.
• A partir de una librería de cDNA se puede hacer
  igualmente. Esto es especialmente importante
  cuando se clonan genes de eucariotas.

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Métodos de marcaje sin radiactividad

• Es posible hacer sondas marcadas con compuestos
  que luego pueden ser detectados por métodos de
  fluorescencia o luminiscencia.
• Ejemplos sondas biotiniladas, marcadas con
  enzimas, o con sustratos de anticuerpos.

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En que casos se puede usar la técnica

• Cuando el gen deseado se expresa a un alto nivel
  en un tipo de célula de la que tenemos una
  genoteca de cDNA.
• Cuando la secuencia de aminoácidos de la proteína
  deseada se conoce total o parcialmente.
• Cuando el gen que se busca es miembro de una
  familia de genes relacionados.

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Identificación de productos de traducción

• Se basa en la inmunodetección del producto de un
  gen.
• Si se cuenta con una muestra purificada de la
  proteína, esta puede inyectarse a un animal
  (ratón, rata o conejo).
• Después de trés días, y durante un tiempo, el
  animal producirá anticuerpos contra la proteína,
  que se pueden purificar.

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Bases de la técnica de inmunoensayo

• El anticuerpo (anticuerpo primario) reconoce la
  proteína en el clon que la expresa y se une a
  ella.
• Un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) que
  reconoce al anticuerpo secundario y lleva una
  actividad enzimática unida, se une.
• Se añaden los componentes para que se efectúe la
  reacción enzimática del anticuerpo secundario,
  generalmente dando lugar a luz o un color
  reconocible.
• Principio del proceso.

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Problemas

• Normalmente, las proteínas que se desean expresar
  en bacterias provienen de otros organismos
  (eukariotas).
• La existencia de intrones, y las distintas
  secuencias promotoras impiden la transcripción y
  traducción correcta de los genes.
• A veces, el código genético de las bacterias no
  coincide exactamente con el del organismo
  original.
• Para superar estas dificultades, se emplean
  vectores especiales llamados vectores de
  expresión. También existen cepas que reconocen
  códigos genéticos consensuados con diversos
  organismos.
• Un vector de expresión tiene un promotor fuerte
  de una bacteria, antes de la MCS.
• Gracias a estas medidas, se han podido producir
  hormonas humanas en bacterias.