RIA

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RIA

• Inmunoanálisis Radiométrico

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Aplicaciones del RIA

• Determinación de la concentración de un antígeno
  presente en una muestra problema.
• Determinación de los parámetros de interacción
  primaria (concentración y afinidad) del
  anticuerpo (Mab o Pab).
• Control de calidad de biomoléculas (test de
  paralelismo)
• Estudios de inmunorreactividad cruzada
  (especificidad y selectividad).

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Fundamento Competición por el sitio de unión al
anticuerpo, entre el antígeno marcado
radiactivamente (trazador) y el antígeno no
marcado (antígeno frío).
Ac Ag
Ac Ag
k1
b
f
Ac Ag
Ac Ag
k2
b
f
Si k1k2
TCfb
Bb/TC100
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Método sensible para detectar un antígeno(Ag)
presente en una muestra problema

• Para esto se deben cumplir con ciertos
  requisitos
• El trazador ( Ag marcado) debe estar en muy baja
  cc ( 0.1/k).
• El anticuerpo debe ser especifico y con una alta
  afinidad por el antígeno y debe hallarse en
  concentración del órden de 1/k.
• Las inmunorreactividades del antígeno marcado y
  del antígeno frío deben ser idénticas frente al
  anticuerpo.
• La interacción Ag Ac obedece a la ley de acción
  de masas sin que existan efectos alostéricos ni
  cooperativos.
• La condición considerada luego de la interacción
  Ag Ac es la del equilibrio.
• Las formas libres y unidas del trazador deben ser
  separables.

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Puesta a punto de un RIA

• Ensayo de titulación del Anticuerpo.
• Curva dosis-respuesta para determinar el rango
  útil de detección.

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Titulación del Anticuerpo Objetivo encontrar
la dilución del Ac capaz de captar el 50 del
trazador agregado (B/F1)

• Concentración fija de trazador en todos los
  tubos(10000 cpm)
• Diluciones crecientes de Anticuerpo.
• Diluyente .
• Control de unión inespecífica ( con suero no
  inmune ).
• Tubo de cuentas totales ( CC de trazador
  utilizada en todos los tubos).
• Se incuban 4º C de 1-5 días o 37º C de 2 a 18 hs
• Separación del Ag libre del unido ( PEG 6000,
  Proteína A/G Sefarosa, etc).
• Conteo en contador gama o beta.

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Qué dilución de Ac uso para que el ensayo sea
óptimo ?
B/F k q- k B
B ? 0
B/F k q
50
X
La dilución óptima de Ac es aquella que capta el
50 del antígeno agregado. Esa zona de la curva
es la de mayor sensibilidad y la de menor DMD
(pequeñas variaciones en la CC del antígeno
producen variaciones significativas en la
respuesta)
B 50 F 50 B/F 1 kq
q 1/ k af
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2. Concentración óptima de trazador (Ag)
Actividad Específica Relación entre la
actividad (uCi) y la masa (ug) de la molécula
marcada
AE uCi/ug
El trazador debe poseer una AE suficiente para
que la masa agregada al tubo (10000 cpm) sea
infinitesimal (condición de traza). En este caso
el Bound se acerca a 0.
B/F k q- k B
B/F k q
B ? 0
De este modo, utilizando una concentración lo
suficientemente baja del antígeno marcado(
trazador), la respuesta (B/F) sólo dependerá de
los parámetros afinidad (k) y concentración (q)
del anticuerpo.
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• Ensayo de desplazamiento

• Trazador.
• Dilución de Ac elegida.
• Concentraciones crecientes del Standard.
• Muestra problema (Mx).
• Tubo de cuentas totales (CT).
• Unión inespecífica ( con Standard en exceso).
• Bo máxima señal ( trazador solo, en ausencia de
  Ag frío).

Incubar 1-5 días a 4ºC ó 2-18 hs a 37ºC
Luego se separan lo libre de lo unido ( PEG 6000
al 15 y a 4º C Proteína A/G Sefarosa).
f
Centrifugar/decantar
Conteo (cpm/dpm)
b
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Curvas Dosis Respuesta
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• Para evitar errores de interpolación en
  concentraciones extremas de Antígeno ( alta
  incertidumbre) se puede realizar una
  rectificación de las CDR.
• Logit y ln y y B/ Bo
• 1-y Logit B/Bo ln B/Bo
• (1- B/Bo)
• Dosis(ng/ml) (B/Bo) c logit (B/Bo) c
• 0.026 0.89 2.09
• 0.052 0.79 1.32
• Mx 0.68 0.75

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Variables que afectan la sensibilidad de un RIA

• Cc del Anticuerpo
• Que pasa si pongo Ac en exceso ? La curva se
  corre a
• la derecha y se pierde sensibilidad. La DMD
  es mayor.
• Que pasa si pongo Ac mas diluido ? Al estar tan
  diluido el Ac la probabilidad de que interaccione
  con el trazador es menor y la señal disminuye. Se
  desplaza con dosis menores.
• AE UCi/ug
• Que pasa si la AE es menor ? Esto puede suceder
  cuando el antígeno no esta bien purificado o
  decae el radiactivo. Su masa deja de ser
  despreciable.
• Que pasa si la AE aumenta ? Puede alterarse la
  estabilidad e inmunorreactividad del trazador.

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Otra aplicación Estudiar los parámetros de
interacción primaria mediante estimando la
afinidad (k) y la capacidad de unión (q) de los
Acs.
(monoclonal) B/F K q K B (Existe una
relacion lineal entre la señal B/F y la CC Molar
del antígeno unido al Ac (Bound).)
CURVA DE SCATCHARD
CURVA DOSIS-RESPUESTA
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Un anticuerpo monoclonal genera un gráfico de
Scatchard lineal

• m -k Afinidad del anticuerpo.
• La intersección de la recta en las abscisas es
• q concentración de sitios totales de
  anticuerpos.
• Conociendo por un método diferente la
  concentración del anticuerpo puedo conocer la
  valencia del mismo
• q/(Ac).

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Un anticuerpo policlonal genera un gráfico de
Scatchard curvilíneo
qTq1q2