Manipulacin del DNA

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Manipulación del DNA
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Temas

• Rango de enzimas de manipulación
• Enzimas para cortar el DNA
• Enzimas para unir DNA (ligar)

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Rango de enzimas de manipulación

• Nucleasas cortan, rebajan o degradan DNA.
• Ligasas juntan moléculas de DNA.
• Polimerasas hacen copias de DNA o RNA
• Enzimas modificadoras Añaden o eliminan grupos.
• Topoisomerasas introducen o eliminan
  superenrrollamiento de DNA circular cerrado.

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Nucleasas

• Enzimas que degradan el DNA hidrolizando el
  enlace fosfodiester que une un nucleótido al
  siguiente.
• Exonucleasas actúan sobre los extremos del DNA.
  Pueden actuar sobre dos hebras (Bal31) o una
  hebra (exonucleasa III).
• Endonucleasas actúan sobre enlaces internos de
  la molécula de DNA. Pueden actuar sobre una hebra
  (S1) o los dos (DNAsa 1). También pueden ser
  específicas de una secuencia concreta. En este
  caso, se denominana Endonucleasas de restricción.
• Descubrimiento de las endonucleasas de restricción

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Ligasas

• En la célula, tienen como función corregir las
  discontinuidades causadas por daños, por ejemplo
  en la replicación.
• Su papel en la biotecnología es el de unir
  fragmentos distintos de DNA, tanto si son romos,
  como si son cohesivos. Animación

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Polimerasas

• Enzimas que sintetizan una hebra de DNA a partir
  de una plantilla de DNA o RNA. La mayoría solo
  pueden empezar desde una zona de doble hebra
  (primer). Hay cuatro tipos en uso
• DNA Pol I Se une a una zona monocatenaria corta
  y sintetiza DNA a la vez que corta la dobre hebra
  delante de si. El fragmento Klenow es una
  modificación que solo tiene actividad polimerasa
  y sirve para rellenar DNA.

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Polimerasas II

• Taq polimerasa, es una polimerasa termoestable
  que se emplea para PCR. Otras enzimas son
  inestables a las temperaturas del PCR.
• Trascriptasa reversa, es una enzima vírica que es
  capaz de sintetizar una cadena de DNA a partir de
  una cadena de RNA. Es especialmente indicada para
  hacer cDNA.

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Enzimas modificadoras

• Fosfatasa alcalina. Elimina el fosfato del
  extremo 5 en el DNA. Facilita el control de la
  ligación en procesos de clonaje.
• Polinucleótido kinasa. Tiene el efecto opuesto a
  la enzima anterior. Añade el grupo fosfato el
  extremo 5.
• Deoxinucleotidil transferasa terminal. Añade uno
  o mas nucleótidos en el extremo 3 del DNA. Es
  particularmente útil cuando se trata de unir
  extremos romos.
• Topoisomerasas. Son importantes en la biología,
  pero aún no han sido empleadas como herramienta
  en la biotecnología.

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El empleo de las endonucleasas de restricción en
biotecnología

• Reconocen una secuencia concreta de 6
  nucleótidos, pero algunas reconocen, 4,5,8 y más.
  Algunas de estas secuencias son variables (Hinf1
  corta en la secuencia GANTC).
• Hoy en día se conocen cientos de endonucleasas de
  restricción. Hay programas que ayudan a
  identificar cual es la endonucleasa que mas se
  ajusta a una secuencia determinada.
• Frecuencia de los cortes. Estadísticamente, un
  corte tendría que ocurrir con una frecuencia de
  una vez cada 4n nucleótidos (n número de
  nucleótidos en la secuencia reconocida). Esto
  sería 1/256, 1/1024 y 1/4096 para n 4,5y6. En la
  realidad, el número es menor, ? (49Kb) tiene 6
  sitios BgII, 5 BamH1 y solo 2 SalI. Esto muestra
  que los nucleótidos no se distribuyen al azar.
• Las endonucleasas de restricción pueden emplearse
  en experimentos para hacer mapas de DNA.
• Ver ejercicio en la próxima imagen.

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Análisis de restricción del bacteriófago ?

• Xba1 2 fragmentos 24.0, 24,5 Kb
• Xho1 2 15.0, 33.5 Kb
• Kpn1 3 1.5, 17.0, 30.0 Kb
• Xba1Xho1 3 9.0, 15.0, 24.5 Kb
• Xba1Kpn1 4 1.5, 6.0, 17.0, 24.0

Xho1 Xba1
15 9.0 24.5
Kpn1 en condiciones limitantes 6 fragmentos 1.5,
17.0, 18.5, 30.0, 31.5 y 48.5
Xho1 Xba1 Kpn1s
15 9.0 6.0 1.5 17
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Ligación

• La ligación de extremos cohesivos es mucho mas
  probable que la de extremos romos.
• Cuando los extremos son romos o cohesivos pero no
  compatibles, es necesario adaptarlos.
• Los linkers. Son cadenas cortas de DNA de
  secuencia conocida, sintetizados in vitro.
  Normalmente contienen una secuencia de una
  endonucleasa de restricción.
• Se unen a la cadena de DNA deseada, y
  posteriormente se hidrolizan con la endonucleasa
  de restricción deseada, generando los extremos
  cohesivos deseados.
• Los adaptadores son como los linkers, pero tienen
  sys extremos ya cohesivos, y se unen sin
  necesidad de endonucleasas de restricción.
• Una última opción consiste en crear colas de
  mononucleótidos, con una deoxinucleotidil
  transferasa terminal. En un fragmento se adjunta
  un polinucleótido, y en el otro, un
  polinucleótido complementario. Este método no es
  muy preciso, y las discontinuidades se suelen
  rellenar con fragmento Klenow.