Diapositiva 1

1
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas
OBJETIVOS
Conocer las características de los enzimas
inmovilizadas y los diferentes métodos de
inmovilización.
Tener una visión general de los diferentes
métodos enzimáticos de análisis que utilizan
enzimas inmovilizadas
2
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas

• Introducción

• Métodos de Inmovilización

• Propiedades de las enzimas inmovilizadas

• Aplicaciones Analíticas

3
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas

• Introducción

• Métodos de Inmovilización

• Propiedades de las enzimas inmovilizadas

• Aplicaciones Analíticas

4
Introducción
Enzimas en disolución
Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para
la determinación de sustratos, activadores,
inhibidores.

• Las enzimas son solubles en medio acuoso y no
  pueden reutilizarse
• Estabilidad limitada. Preparación de
  disoluciones con frecuencia

Costes elevados
Inmovilización de enzimas
Proceso por el que se confina la enzima en un
soporte adecuado para obtener una forma insoluble
de la misma que retiene su actividad catalítica

• Posibilidad de reutilizar la enzima
• Aumento de la estabilidad del preparado

5
Introducción
Aplicaciones Analíticas Diseño de
biosensores Reactores enzimáticos
Enzimas inmovilizados
Aplicaciones Médicas Tratamiento con enzimas
inmovilizados
Aplicaciones Industriales
Industria farmacéutica Industria
alimentaria Industria química
6
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas

• Introducción

• Métodos de Inmovilización

• Propiedades de las enzimas inmovilizadas

• Aplicaciones Analíticas

7
Métodos de Inmovilización
Retención física
Inmovilización química
Con formación de enlaces covalentes
Sin formación de enlaces covalentes
Adsorción
Entrecruzamiento
Unión covalente
Atrapamiento o inclusión
8
Métodos de Inmovilización
Inmovilización por Adsorción
Interacción física, no específica (puentes de
hidrógeno interacciones hidrofóbicas,
interacciones iónicas, interacciones de van der
Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.

• El método más sencillo
• De aplicación general
• Coste moderado

Uniones Reversibles No covalentes

• Estabilidad limitada, se requiere un control
• riguroso de las condiciones de trabajo para
• evitar pérdidas de enzima por desorción.

Alumina, carbón activo, vidrio Resinas cambiadoras
9
Métodos de Inmovilización
Retención física
Inmovilización química
Adsorción
Entrecruzamiento
Unión covalente
Atrapamiento o inclusión
10
Métodos de Inmovilización
Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o
matriz porosa
Formación de un polímero altamente
entrecruzado en presencia de la enzima. Esta
queda atrapada en los poros de la matriz
polimérica formada.

• Se requiere controlar las condiciones de
• polimerización para que no se produzcan
• alteraciones en la molécula enzimática
• Se puede perder proteína lentamente

• Se pueden obtener membranas con
• enzimas inmovilizadas
• De aplicación general

Gel de poliacrilamida Polímeros conductores
11
Métodos de Inmovilización
Atrapamiento por microencapsulación
Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm
diámetro) dentro de membranas semipermeables de
polímeros que permiten la difusión de sustratos
y productos pero no de la proteína.

• Se requieren elevadas
• concentraciones de proteína
• en disolución acuosa (10 mg/L)

Membrana polimérica obtenida en un proceso de
polimerización en la interfase disolución
orgánica- acuosa
12
Métodos de Inmovilización
Retención física
Inmovilización química
Adsorción
Entrecruzamiento
Unión covalente
Atrapamiento o inclusión
13
Métodos de Inmovilización
Métodos Químicos no polimerizantes- Unión
covalente
Formación de enlaces covalentes entre el enzima y
el soporte pero no entre las moléculas de enzima.
El tipo de soporte determina la química de la
inmovilización
Soporte
Enzima
Activación para obtener grupos funcionales
reactivos
Asegurar que el centro activo de la enzima no se
ve afectado por los reactivos empleados en el
proceso de inmovilización. Se puede proteger el
centro activo con un análogo del sustrato o un
inhibidor competitivo durante el proceso de
inmovilización.
14
Métodos de Inmovilización Unión Covalente
1. Método de la acyl-azida para unión a soporte
con grupos ácido
Activación de soporte para obtener un grupo
acil-azida
Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar
a un enlace amida
Son más reactivas las aminas primarias (lisina),
aunque también reaccionan residuos de cisteina,
serina y tirosina.
15
Métodos de Inmovilización Unión Covalente
2. Método de la carbodiimida para unión a soporte
con grupos ácido
Activación del soporte para dar un derivado
acilisourea por reacción con carbodiimida
Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y
metionina
La selectividad de la reacción mejora si se añade
un derivado de N-hidroxisuccinimida durante la
etapa de activación del soporte. Se forma un
ester de N-hidroxisuccinimida que forma
selectivamente enlace amida con residuos de Lisina
16
Métodos de Inmovilización Unión Covalente
3. Unión a través de enlace azo
Activación del soporte para obtener una sal de
diazonio
Unión a la enzima a través de un residuo de
tirosina

• Inmovilización covalente selectiva a través de
  residuos de tirosina
• Evita entrecruzamiento enzima-enzima

17
Métodos de Inmovilización
Retención física
Inmovilización química
Adsorción
Entrecruzamiento
Unión covalente
Atrapamiento o inclusión
18
Métodos de Inmovilización
Entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes intermoleculares
(entre moléculas de enzima) y entre estas y el
soporte

• Cantidades altas de proteína inmovilizada
  resistentes a condiciones
• extremas de pH y temperatura

• Las redes de moléculas entrecruzadas que se
  forman dificultan el
• acceso del sustrato al centro activo ?
  Pérdidas de actividad tras
• la inmovilización altas

Reactivos bifuncionales más utilizados
Hexametileno-bis(iodoacetamida)
Diazobenzidina
Glutaraldehido
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
19
Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento
Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido

• Método simple y sencillo
• Se verifica en condiciones de pH neutro

• Para minimizar las pérdidas de actividad
  enzimática
• se puede optar por un método de
  co-reticulado
• entrecruzamiento de la enzima con una
  proteína sin actividad
• enzimática y rica en lisina, ej. albúmina
  bovina.

20
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas

• Introducción

• Métodos de Inmovilización

• Propiedades de las enzimas inmovilizadas

• Aplicaciones Analíticas

21
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas
difieren de las de las enzimas en disolución
debido a efectos del material soporte y a cambios
conformacionales de la enzima
Efectos sobre la estabilidad Efectos en las
propiedades cinéticas
Inmovilización
1. Efectos en la Estabilidad

• Estabilización conformacional de la enzima
• por uniones multipuntuales enzima-soporte

Mayor resistencia a desactivación térmica o
química

• Alteración del microentorno de la enzima

Por ejemplo mayor estabilidad en medios
orgánicos sobre soportes hidrofílicos
22
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
2. Efectos de la inmovilización sobre las
propiedades cinéticas
Ssuperficie lt Sdisolución
1
S2
S
S1
Sdis.
Los valores de KM y vmax para las enzimas
inmovilizadas son aparentes (KM y vmax)
KM suele ser mayor que KM
Capa de difusión
Disolución
0
Distancia a la Superficie del soporte
23
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Efectos de microentorno ? Cambio del pH óptimo de
la enzima
Quimotripsina/ portador catiónico
Quimotripsina en disolución
100
Actividad relativa
Quimotripsina/ portador aniónico
4
6
8
10
pH
Sobre soportes catiónicos OH-superficiegtOH-di
solución pHsuperficiegt pHdisolución
Sobre soportes aniónicos HsuperficiegtHdisol
ución pHsuperficielt pHdisolución
24
Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas
Inmovilizadas

• Introducción

• Métodos de Inmovilización

• Propiedades de las enzimas inmovilizadas

• Aplicaciones Analíticas

25
Aplicaciones Analíticas
SENSORES QUÍMICOS
Esquema general de un sensor químico
ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO
TRANSDUCTOR
ELECTRÓNICA
Un sensor es un dispositivo que responde de forma
directa, continua, rápida, selectiva y
reversible a los cambios de concentración de una
especie química en una muestra compleja,
idealmente sin tratamiento previo de la
misma. Consta de un elemento de reconocimiento
molecular (que produce una interacción selectiva
(específica) con el analito), en contacto físico
con un transductor.
26
Elementos de reconocimiento molecular empleados
en el desarrollo de sensores
27
Transductores empleados en el desarrollo de
sensores
analito
Proceso de reconocimiento selectivo
Transducción Energía
Piezoeléctricos (de masa)
Electroquímicos
Ópticos
Térmicos
Amperométrico
Potenciométrico
Conductimétrico
Respuesta-Procesamiento de datos
Secuencia de procesos en la operación de un
sensor químico. Se resumen los distintos tipos de
transductor que pueden ser utilizados
28
BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS ENZIMÁTICOS Sensor
de Urea
Transductor (Electrodo selectivo)
Interferencias
Tiempo de Rango de

respuesta linealidad
Control pH (tampón dil.)
pH
1 min
5?10-5-10-3 M
NH4
K (Na)
35 s
5?10-5-10-1 M
Capa de enzima inmovilizada
Estabilidad del sensor
Métodos de inmovilización del enzima
Encapsulación en membranas de diálisis
10 d.
Inclusión en gel de poliacrilamida
21 d.
Inclusión enlace covalente en ácido poliacrílico
?30 d.
Entrecruzamiento con albúmina (glutaraldehido)
?60 d.
29
SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.
Sensor de oxígeno de Clark (no enzimático)
Proceso catódico O2 2 H 2 e-
H2O2
-600
3.25
Eap./ mV
i./ µA
Proceso anódico 2 Ag(s) 2 Cl-(aq)
2AgCl(s) 2 e-
Electrolito interno (KCl)
Ánodo de Ag/AgCl
Cátodo de Pt
Características de respuesta Corriente de
difusión estacionaria
Membrana de Polímero (PTFE)

• espesor de la membrana
• porosidad de la memb.
• q factor de tortuosidad

?
D
i nFA Co
?
q
Tiempo de respuesta
?2
test ? 20 50 s
test. 2
(D/q)
30
SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS 1. Basados en
el empleo de enzimas oxidasas
E
Señal (i/ µA)
SH2 O2 S H2O2
Eapl cte
1. Medida del peróxido de hidrógeno generado
transductor
2. Empleo de un mediador de transferencia
electrónica (Med) (el O2 se sustituye por un
aceptor de electrones no fisiológico)
Enzima inmovilizada
31
SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS 2. Basados en
el empleo de enzimas deshidrogenasas