FLUOROFOROS

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FLUOROFOROS
Gregorio Weber 1916-1997
La versatilidad de la fluorescencia no radica en
el aparato, sino en la gran variedad de sondas
fluorescentes disponibles
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LA CLAVE ES EL FLUOROFORO solo moléculas con
r0 ? 0 se puede usar para medir difusión
rotacional. Y sólo sirven aquellos con ? del
orden de ?rot para medir pH o Ca2 sólo sirven
aquellos fluoróforos sensibles a H o Ca2 para
microscopía de fluorescencia son útiles aquellos
con ? que no sea absorbida por la muestra etc,
etc...
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FLUOROFOROS EXTRINSECOS
PROTEINAS TRP el mayor contribuyente, muy
sensible al entorno. ? ? 1-6 nseg. Quencheado por
S-S cercanos, I-, acrilamida, O2, benceno (PHE),
etc, y por grupos cercanos deficientes de
electrones (-NH3) TYR minoritario, en general
esta quencheado por la cadena peptídica o por
FRET a TRP
PHE se detecta únicamente en proteínas sin TYR o
TRP
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COFACTORES (son los que dominan la fluorescencia
en un tejido)
NADH ?ex 340 nm ?em 460 nm (anillo
reducido de nicotinamida) ? 0.4 nseg en agua,
quencheado por la adenina al unirse a una
proteína Q puede subir hasta 4 veces y ? ? 1.2
nseg debido a que aumenta la distancia
dependiendo del entorno la intensidad puede
aumentar o disminuir NAD no fluoresce
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PIRIDOXAL FOSFATO se une a LYS por base de
Schiff el espectro depende del tipo de entorno
proteico
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FAD, ROBOFLAVINA, FMN
?ex? 450 nm ?em? 525 nm FADH no fluoresce FMN ?
? 4.7 nseg FAD ? ? 2.3 nseg
Nucleotidos y ácidos nucleicos no
fluorescen COLAGENO y ELASTINA fluorescen
distinto (?em? 405 nm). Se hacen crosslinking de
LYS que resulta en hidroxipiridonio.
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ESPECTROS
1) piridoxamina fosfato 2) piridoxal fosfato 2)
piridoxal fosfato unido a fosforilasa b mediante
una base de Shiff
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EFECTO DE LA UNION DE NADPH a 17?-hydroxysteroid
dehydrogenase
Al excitar a 295 nm se ve FRET TRP-NADPH
Al excitar a 340 nm se ve la fluorescencia del
NADPH, el cual en agua es quencheado
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FLUOROFOROS EXTRINSECOS para DNA, RNA, lípidos
y proteinas (CYS y LYS)
isotiocianato de fluoresceína
5-iodoacetamida fluoresceína
cloruro de dansilo(Weber)
sondas activadas para conjugación con
macromoléculas
7-nitroben-2-oxa-1,3-diazol-4-yl
tetrametil rodamina isotiocianato
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DNS-Cl modifica grupos amino ? 10 nseg ?ex
350 nm (se superpone con la emisión de TRP, se
puede hacer FRET) ?em 520 nm ? 4300
M-1cm-1 sensible a la polaridad del entorno
FITC y DNS-Cl conjugado a un Ab
fluoresceina (? 72000 M-1cm-1) rodamina (?
107000 M-1cm-1) no son muy sensibles a la
polaridad del entorno ? 4 nseg altos Q ? altas,
útil para marcar Ab para inmunofluorescencia
cascade yellow (gran corrimiento de Stokes y alta
solubilidad en agua)
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Para marcar proteinas es preferible una sonda
que sea soluble en agua (limitante con DNS-Cl)
presente un corrimiento de Stokes grande
(limitante con FITC, R0 40Å) para evitar
problemas de FRET entre las sondas. La
fluoresceína tiene un corrimiento chico y hace
transferencia consigo misma, muchas veces se ve
que a altos grados de modificación la
fluorescencia es menor Cascade yelow cumple estos
dos requisitos. Recientemente se introdujeron
los BODIPY son las alternativas más
modernas para las fluoresceínas y rodaminas.
presentan un rango amplio de espectros (510-675
nm) Q 1 ? 80000 M-1cm-1 insensibles a la
polaridad y pH problema auto-RET
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Como modificar una macromolécula? Generalmente
se modifican los grupos amino (Lys,N-terminal) o
tiol (Cys) MODIFICACION DE GRUPOS AMINO
ISOTIOCIANATOS
ESTERES ACTIVOS
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ESTERES ACTIVOS
SULFOTETRAFLUOROFENIL
CLORURO DE ACIDO
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MODIFICACION DE CISTEINA
N-etilmaleimida
halo-?-cetonas
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Sondas de membrana se puede usar sondas
liposolubles (DPH), a las cuales se les puede dar
un grupo polar para orientarla en la interfase
(TMA-DPH) se puede variar a voluntad la
distancia entre la interfase y la sonda
(viscosidad de membranas)
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(No Transcript)
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Sondas para potencial de membrana
(sensa el potencial eléctrico)
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SONDAS PARA DNA
mayor afinidad
EB su fluorescencia aumenta 30 veces al unirse a
dsDNA (?? 1.7 nseg en H20, ? 20 nseg unido a
dsDNA). Se intercala (igual que el naranja de
acridina) Otros se unen al surco menor DAPI,
Hoechst33342
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También se pueden usar análogos de bases
fluorescentes
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Y el resto es ingenio. Cómo medir una proteasa?
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(No Transcript)
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La activación ocurre espontáneamente, sólo
necesita oxígeno
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Y cambiando algunos residuos clave se puede
modular el espectro
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Pero aparte de la GFP, se puede marcar
específicamente otra proteína in vivo?
recientemente se desarrolló una técnica que lo
permite - se introduce un quelante de Ar en un
loop (Cys-Cys-X-X-Cys-Cys) - se la expresa in
vivo y se agrega FlAsH
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Ahora vamos a ver como el entorno puede modificar
el espectro de fluorescencia. Muchas aplicaciones
se basan en esto.