CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS

1
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS
CARBOHIDRATOS

• MONO Y DISACÁRIDOS
• SOLUBILIDAD
• MUY SOLUBLES EN AGUA
• MENOS SOLUBLES EN ETANOL
• ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON AGUA CALIENTE
• INSOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS (EXCEPTO
  PIRIDINA)

2
IMPORTANCIA DE LA SOLUBILIDAD DE LOS CARBOHIDRATOS

• INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA REALIZAR
  DETERMINACIONES DE DENSIDAD.
• EXISTE RELACIÓN ENTRE SU DENSIDAD Y SU
  CONCENTRACIÓN

3
ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

• MUY ÚTIL PARA DETERMINAR SU CONCENTRACIÓN.
• EXACTO SÓLO PARA SOLUCIONES DE PURA SACAROSA.
• AMPLIAMENTE USADO PARA APROXIMAR VALORES PARA
  OTRAS SOLUCIONES AZUCARADAS.

4
ROTACIÓN ÓPTICA DE LOS CARBOHIDRATOS

• FACILITA AL MÉTODO PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN
  DEL AZÚCAR EN SOLUCIÓN.
• MÉTODO BASADO EN MEDICIONES POLARIMÉTRICAS.
• GENERALMENTE UTILIZADO CON SACAROSA Y ALMIDÓN.

5
PROPIEDADES REDUCTORAS DEL GRUPO CETO O ALDEHÍDO

• EL GRUPO CETO O ALDEHÍDO REDUCIRÁN SOLUCIONES
  ALKALINAS DE SALES METÁLICAS AL METAL ÓXIDO O
  LIBRE.
• LA REACCIÓN ENTRE EL AZÚCAR Y EL SULFATO CÚPRICO
  NO ES ESTEQUIOMÉTRICA Y PROPORCIONA ÓXIDO CUPROSO
  MUY DEPENDIENTE DE LAS CONDICIONES DE LA REACCIÓN.

6
REACCIONES DE CONDENSACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

• MONOSACÁRIDOS ÁCIDO FUERTE CALOR ?
  SUBSTANCIAS QUE SE CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G.
  FENOL) PARA PROPORCIONAR COMPLEJOS COLOREADOS.
• PÉRDIDA DE AGUA Y FORMACIÓN DE DERIVATIVOS DEL
  FURFURAL.
• (SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL ÁCIDO, EL TIEMPO
  Y LA VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO)

7
REACCIONES DE SUSTITUCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

• FORMACIÓN DE ÉTER (E.G. METIL ÉTERES)
• ESTERIFICACIÓN (E.G. ACDETATOS DE ALDITOL)
• IMPORTANTES EN LA PREPARACIÓN DE DERIVADOS
  VOLÁTILES PARA LA CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.

8
PROPIEDADES DE LOS POLISACÁRIDOS

• SOLUBILIDAD.- VARÍA ENORMEMENTE
• DEXTRINAS (ALMIDONES DE VARIAS COMPOSICIONES
  PARCIALMENTE HIDROLIZADOS)
• AMILOPECTINA Y GLUCÓGENO.- SE DISPERSAN
  PARCIALMENTE EN AGUA CALIENTE.

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SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS

• SUBSTANCIAS PÉCTICAS.- SOLUBLES EN AGUA CALIENTE
  A MENOS QUE CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca.
• GOMAS, MUCÍLAGOS, ARABINOXILANOS, ß-GLUCANOS.-
  SOLUBLES EN AGUA

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SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS

• CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y XILANOS,
  HEMICELULOSA.- INSOLUBLES EN AGUA.
• EN GENERAL LOS POLISACÁRIDOS SON INSOLUBLES EN
  ALCOHOLES ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA DE 75 A
  80 (v/v).

11
FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE LOS POLISACÁRIDOS

• EL ALMIDÓN FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON EL
  YODO EN SOLUCIÓN DE NaCl/KI.
• LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DE LAS ALGAS DE TIPO
  CARRAGENO FORMAN COMPLEJOS CON LOS COMPUESTOS
  CUATERNARIOS DE AMONIO

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HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS

• LA MAYORÍA DE LOS POLISACÁRIDOS SON SUJETOS A LA
  HIDRÓLISIS EN PRESENCIA DE ÁCIDOS DILUIDOS.
• LA MAYORÍA DE LOS COMPONENTES DE LA HIDRÓLISIS
  SON ESTABLES EN LOS ÁCIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA
  FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)

13
SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS

• LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA
  (SE NECESITAN 72 (p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA)
• LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO DE UN POLISACÁRIDO
  CONFIEREN ESTABILIDAD EN EL ENLACE GLUCOSÍDICO
  ADYACENTE.

14
SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS

• LA MAYORÍA DE LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO SE
  LIBERAN EN COMBINACIÓN CON OTRO RESIDUO,
  PRODUCIENDO UN DISACÁRIDO EXTREMADAMENTE
  RESISTENTE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA.

15
DETERMINACIÓN DEAZÚCARES LIBRES

• PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• CUANDO LOS AZÚCARES ESTÁN EN SOLUCIÓN
• GASES DISUELTOS.- REMUÉVANSE DE LOS PRODUCTOS
  CARBONATADOS O FERMENTADOS MEDIANTE VACÍO

16
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

• PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR CON LAS REACCIONES.
  EXISTEN MUCHAS MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G.
  CARBÓN O SALES DE PLOMO)
• ACETATO DE PLOMO BÁSICO.- INTERFERIRÁ CON LOS
  MÉTODOS POLARIMÉTRICOS.

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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

• ACETATO DE PLOMO NEUTRO.- FORMA PREFERENTE DE
  USO. SE UTILIZA COMO UNA SOLUCIÓN ACUOSA
  SATURADA. SE ELIMINA EL EXCESO AÑADIENDO YA SEA
  OXALATO DE SODIO O POTASIO.

18
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

• DESPROTEINIZACIÓN
• LAS PROTEÍNAS INTERFIEREN CON LAS
  DETERMINACIONES REDUCTORAS Y COLORIMÉTRICAS. EL
  USO DE TCA (ÁCIDO TRICLOROACÉTICO) ES DEMASIADO
  FUERTE PARA DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN
  SOLUCIÓN CONTIENE DISACÁRIDOS O FRUCTOSA.

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DESPROTEINIZACIÓN DE LAMUESTRA

• MÉTODOS ACEPTABLES
• AÑÁDASE ETANOL O ACETONA AL 70 (v/v). LA MAYORÍA
  DE LAS PROTEÍNAS COAGULARÁN Y SE PODRÁN FILTRAR O
  CENTRIFUGAR.

20
DESPROTEINIZACIÓN DE LAMUESTRA

• b) PRECIPITACIÓN CON METALES PESADOS BAJO
  CONDICIONES ALKALINAS. EJEMPLO LA SOLUCIÓN
  CARREZ PRECIPITA PROTEÍNAS, ABSORBE ALGUNOS
  COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.

21
PROCEDIMIENTO

• SE AÑADE A LA MUESTRA LÍQUIDA SOLUCIÓN CARREZ I
  (HEXACIANOFERRATO DE POTASIO, K4Fe(CN)63H2O),
• SE AÑADE A LA MUESTRA SOLUCIÓN CARREZ II (SULFATO
  DE ZINC (ZnSO47 H2O), Y SOLUCIÓN DE NaOH.
• SE ENFRÍA, SE DILUYE A UN VOLUMEN DETERMINADO Y
  SE FILTRA.

22
PREPARACIÓN DE LA MUESTRAINCLUYENDO LA
EXTRACCIÓN DE AZÚCAR

• SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UN EXTRACTOR SOXHLET
• SE AÑADE LA MUESTRA AL ETANOL AL 80 (v/v,
  CONCENTRACIÓN FINAL) HIRVIENDO. LOS POLISACÁRIDOS
  SON INSOLUBLES Y EL CALOR INACTIVA A LAS ENZIMAS.

23
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA
EXTRACCIÓN DE AZÚCAR

• PUEDE AÑADIRSE CARBONATO DE CALCIO PARA
  NEUTRALIZAR LOS ÁCIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE ÉSTOS
  PUEDEN OCASIONAR LA HIDRÓLISIS DE LOS
  POLISACÁRIDOS.
• TAMBIÉN SE DEBE USAR EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN
  BUFFER PARA EVITAR LA HIDRÓLISIS ÁCIDA

24
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA
EXTRACCIÓN DE AZÚCAR

• EN CASO DE QUE SE NECESITE ELIMINAR EL ETANOL DEL
  EXTRACTO PREVIO AL ANÁLISIS SE PUEDE REALIZAR
  ESTE PASO MEDIANTE VACÍO. TAMBIÉN SE PUEDE
  REALIZAR CALENTANDO LEVEMENTE EN BAÑO MARÍA BAJO
  CAMPANA DE EXTRACCIÓN O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS DECARBOHIDRATOS

• MÉTODOS QUÍMICOS
• MÉTODO FLUORIMÉTRICO
• MÉTODOS ENZIMÁTICOS
• CROMATOGRAFÍA DE GASES
• CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
• MÉTODOS FÍSICOS

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MÉTODOS QUÍMICOS

• REACCIONES DEL H2SO4 Y CARBOHIDRATOS
• ÁCIDO FENOL SULFÚRICO
• FUNDAMENTO.- PROVIENE DE LOS PRODUCTOS DE
  REACCIÓN Y DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO Y EL AZÚCAR.

27
ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

• EL AZÚCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE
  HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O FURFURAL (F) LOS
  CUALES SON REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO LA
  ABSORBANCIA A 490nm
• H2SO4
• CONC.
• FENOL CARBOHIDRATO ? AMARILLO NARANJA
• CALOR

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ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

• H
  H
• POLISACÁRIDOS ? MONOSACÁRIDOS ? F HMF
• ?
  ?

29
VENTAJAS DEL MÉTODO

• ES SENCILLO
• ES RÁPIDO
• SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES DE AZÚCAR (E.G. 5µg)
• ESPECÍFICO PARA CARBOHIDRATOS.
• NO EXISTE INTERFERENCIA CON PROTEÍNAS

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VENTAJAS DEL MÉTODO

• A MENUDO NO ES NECESARIA LA CLARIFICACIÓN DE LA
  MUESTRA
• LOS REACTIVOS SON BARATOS Y ESTABLES
• COLOR ESTABLE
• RESULTADOS REPRODUCIBLES
• RESULTADOS CONFIABLES

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DESVENTAJAS DEL MÉTODO

• LOS CARBOHIDRATOS QUE NO PROPORCIONAN HMF Y F EN
  LA DESCOMPOSICIÓN ÁCIDA RESULTAN EN UNA AMPLIA
  GAMA DE COLORES. POR TANTO EL MÉTODO NO MIDE
  TODOS LOS CARBOHIDRATOS

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DESVENTAJAS DEL MÉTODO

• MIDE LA MAYORÍA DE LOS CARBOHIDRATOS PERO LA
  INTENSIDAD DEL COLOR VARÍA AMPLIAMENTE ENTRE LOS
  CARBOHIDRATOS, POR LO QUE SE DEBE SELECCIONAR UNO
  DE ELLOS COMO REFERENCIA

33
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

• LA PROPORCIÓN DE H2SO4 ES MUY IMPORTANTE YA QUE
  SE ADICIONA H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA
  MUESTRA ACUOSA.
• SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIÓN PROVENIENTE DEL
  PAPEL FILTRO O POLVO DE CELULOSA

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ANTRONA ÁCIDO SULFÚRICO(9,10
DIHIDRO-9-OXOANTRACENO)

• FUNDAMENTO
• EL MÉTODO ES BÁSICAMENTE IGUAL AL DEL FENOL
  PERO EL COLOR QUE SE OBTIENE ES AZÚL VERDE Y SE
  LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm.
• TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS QUE
  EL MÉTODO ANTERIOR.

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DETERMINACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES

• AZÚCAR ÁLKALI ? FRAGMENTOS DE AZÚCAR
  REDUCTOR
• 
  
• Cu(OH)2 ?
  COMPLEJO DE COBRE DE
• 
  TARTRATO Y CITRATO
• 
  ?
• ? OH
• H2O Cu2O ?---- CuOH ?---- Cu MEZCLA DE
  ÁCIDOS DE
• 
  AZÚCAR

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SOLUCIÓN DE FEHLING

• FUNDAMENTO
• DOS SOLUCIONES
• SOLUCIÓN A SULFATO DE COBRE CRISTALINO
• SOLUCIÓN B TARTRATO DE SODIO Y POTASIO (O
  CITRATO DE SODIO) HIDRÓXIDO DE SODIO (O
  HIDRÓXIDO DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)

37
SOLUCIÓN DE FEHLING

• FUNDAMENTO
• EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA PRECIPITACIÓN
  DEL HIDRÓXIDO CÚPRICO
• EL ÁLKALI ENOLIZA A LOS AZÚCARES Y PROVOCA SU
  ROMPIMIENTO EN FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN
  OXIDARSE INMEDIATAMENTE Cu (CÚPRICO) ES
  REDUCIDO A Cu (EL IÓN CUPROSO)

38
SOLUCIÓN DE FEHLING

• FUNDAMENTO
• A MEDIDA QUE LOS IONES Cu SE REDUCEN POR
  LOS FRAGMENTOS DE AZÚCAR, LOS IONES Cu SE
  COMBINAN CON LOS IONES HIDROXILO PARA FORMAR
  HIDRÓXIDO DE COBRE (DE COLOR AMARILLO, Cu).

39
SOLUCIÓN DE FEHLING

• FUNDAMENTO
• EL CuOH REDUCIDO PIERDE H2O EN PRESENCIA
  DE CALOR PARA DAR COMO RESULTADO ÓXIDO CUPROSO
  INSOLUBLE (Cu2O)

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SOLUCIÓN DE FEHLING

• FUNDAMENTO
• LA DETERMINACIÓN DEL COBRE REDUCIDO SE
  PUEDE LLEVAR A CABO POR GRAVIMETRÍA, VOLUMETRÍA,
  O POR MÉTODOS ELECTROLÍTICOS.
• EL PESO DEL Cu2O SÓLO ES APLICABLE A
  MUESTRAS RELATIVAMENTE PURAS.

41
DESVENTAJAS DEL MÉTODODE FEHLING

• LA REDUCCIÓN DEL COBRE Y LA OXIDACIÓN DE LOS
  AZÚCARES NO ES ESTQUIOMÉTRICA .
• LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO CUPROSO VARÍA, DEPENDIENDO
  DEL REACTIVO ÁLKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE
  CALENTAMIENTO Y LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES EN
  LA MUESTRA

42
DESVENTAJAS DEL MÉTODODE FEHLING

• LOS AZÚCARES DIFIEREN EN SU HABILIDAD PARA
  REDUCIR LA SOLUCIÓN CÚPRICA, POR TANTO, LA
  TITULACIÓN (O PESO O ABSORBANCIA) DEBEN SER
  CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y POSTERIORMENTE SE
  RECURRIRÁ A TABLAS PARA DETERMINAR LA
  CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR PRESENTE EN LA MUESTRA

43
MÉTODO DE MUNSON WALKER

• FUNDAMENTO
• NaOH Cu AZÚCAR REDUCTOR ? CU AZÚCAR
• 
  ? (Cu2O) OXIDADO
• LA DETERMINACIÓN DEL Cu2O PUEDE SER
  GRAVIMÉTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR TITULAR
  EL ÓXIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE
  UNO DE LOS SIGUIENTES MÉTODOS (SE LLEVAN MUCHO
  TIEMPO)

44
TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

• EL Cu2O REACCIONA CON EL IÓN FÉRRICO (Cu) EL
  CUAL ES REDUCIDO AL IÓN FERROSO (Cu).
  POSTERIORMENTE EL IÓN FERROSO ES TITULADO (2
  ?3) CON PERMANGANATO (3, ROSA ? 2, INCOLORO)
• 1) Cu2O Fe2(SO4)3 ? 2FeSO4 CuSO4 CuO

45
TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

• 2) 10 FeSO4 2KMnO4 8H2SO4 ?
• 5Fe2(SO4)3 K2SO4 2MnSO4 8H2O

46
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO

• SE OXIDA EL Cu A Cu CON ÁCIDO NÍTRICO.
  POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR
  EL EXCESO DE HNO3
• HNO3
• Cu2O ? Cu(NO3)2
• ?

47
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO

• SE AÑADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIÓN DE KI
• 2I- 2Cu ? 2Cu I2

48
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO

• SE TITULA EL I2 LIBERADO CON UNA SOLUCIÓN
  ESTÁNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3)
• S2O3-2
• I2 I- ? I3- ? S4O6-2 3 I-
• (TRIIODURO)
• SE USA ALMIDÓN COMO INDICADOR AZÚL ? INCOLORO

49
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

• NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES
  AZÚCARES REDUCTORES.
• SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100
  A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIÓN.

50
MÉTODO SOMOGY I-NELSON

• AZÚCAR REDUCTOR Cu ? Cu AZÚCAR
• 
  REDUCTOR

51
MÉTODO SOMOGY I-NELSON

• PROCEDIMIENTO

52
Reactivos para el Método de Somogy i y Nelson
para azúcares reductores

• Reactivo de Somogy i
• NaCO3 - Carbonato de sodio
• NaHCO3 Bicarbonato de Sodio
• KaNaC4H4O6 Tartrato de Sodio Potasio
• CuSO45H2O Sulfato de Cobre
• Reactivo de Nelson
• (NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio
• Na2HAsO7H2O Arsenato de Sodio
• H2SO4 Ácido Sulfúrico

53
MÉTODO FLUORIMÉTRICO

• FUNDAMENTO
• ESTE MÉTODO ES POSIBLE CUANDO LOS COMPUESTOS
  ABSORBEN RADIACIÓN A LONGITUD DE ONDA CORTA Y
  LUEGO EMITEN RADIACIÓN A UNA LONGITUD DE ONDA MÁS
  LARGA.

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DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR EL MÉTODO
FLUORIMÉTRICO

• EXTRACCIÓN CON ISO-BUTIL METIL CETONA.
• REACCIÓN CON HIDRACIDA DE ÁCIDO p-HIDROXIBENZOICO
• ADICIÓN DE REACTIVO Y LECTURA A UNA EMSIÓN DE
  470nm
• EXCITACIÓN A 454nm

55
MÉTODOS ENZIMÁTICOS

• INFORMACIÓN GENERAL
• REQUIEREN DE UN EXTRACTO NEUTRO O ÁCIDO
  LIBRE DE ALCOHOLES Y METALES PESADOS (NO SE
  PUEDEN USAR SALES DE PLOMO PARA CLARIFICAR LOS
  EXTRACTOS)

56
APLICACIÓN DE LOS MÉTODOSENZIMÁTICOS

• SON POSIBLES PARA UN GRAN NÚMERO DE CARBOHIDRATOS
  O COMPUESTOS RELACIONADOS
• MONOSACÁRIDOS
• DISACÁRIDOS
• POLISACÁRIDOS
• ALOCHOLES Y POLIOLES
• ÁCIDOS

57
FUNDAMENTO

• GLUCOSA
• EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS SIGUIENTES
  REACTIVOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
• BUFFER,
• o DIANISIDINA 2HCl (CROMÓGENO REDUCIDO)
• CATALASA
• GLUCOSA OXIDASA

58
REACCIONES

• GLUCOSA
• OXIDASA
• H2O O2 GLUCOSA ? LACTONA DE ÁCIDO D-GLUCÓNICO
  H2O
• CATALASA
• H2O2 ? H2O ½ O2
• O2 CROMÓGENO INCOLORO, REDUCIDO ? CROMÓGENO
  AZÚL OXIDADO

59
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA/GLUCOSA

• LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES
  Y DESPUÉS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

60
DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIÓN

• A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK)
  CATALIZA LA FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA MEDIANTE EL
  ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA
  6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA
  GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES ESPECÍFICAMENTE
  OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON LA
  FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO.

61
REACCIONES

• HK
• GLUCOSA ATP ? G6P ADP
• G6P-DH
• G6P NADP ? GLUCONATO-FOSFATO NADPH H
• EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIÓN ES
  ESTEQUIOMÉTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE
  MIDE MEDIANTE EL AUMJENTO EN ABOSROBANCIA A 334,
  340 Ó 365 nm.

62
INVERSIÓN ENZIMÁTICA.

• A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA
  ENZIMA ß-FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y
  FRUCTOSA
• ß-FRUCTOSIDASA
• SACAROSA H2O ? GLUCOSA FRUCTOSA
• EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA
  DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y
  DESPUÉS DE LA INVERSIÓN ENZIMÁTICA

63
CROMATOGRAFÍA DE GASES

• FUNDAMENTO
• LOS AZÚCARES SON COMPUESTOS POLIHIDROXI
  UNIDOS FUERTEMENTE POR HIDRÓGENO YA SEA A AGUA O
  A ELLOS MISMOS EN CRISTALES. POR TANTO, TIENEN
  PUNTOS DE FUSIÓN MUY ALTOS (200-300C)

64
CROMATOGRAFÍA DE GASESFUNDAMENTO

• LOS AZÚCARES SE PUEDEN CONVERTIR EN DERIVADOS
  VOLÁTILES POR MÉTODOS DE UN PASO ANTES DE SER
  SUJETOS A ANÁLISIS POR CG. LOS MÁS CONVENIENTES
  PARECEN SER ACETATOS DE ALDITOL, METIL ÉTERES, Y
  TRIMETISILIL ÉTERES.

65
CROMATOGRAFÍA DE GASESFUNDAMENTO

• LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR LA
  DEGRADACIÓN TÉRMICA DE LOS AZÚCARES,
  PARTICULARMENTE LA PÉRDIDA DE AGUA PARA FORMAR
  DERIVADOS ANHIDRO.
• LOS TRIMEISILIL ÉTERES TIENEN LA VENTAJA DE LA
  COMBINACIÓN DE ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE
  PERMITEN LA DETERMINACIÓN POR CG DE
  OLIGOSACÁRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS

66
CROMATOGRAFÍA DE GASESPROCEDIMIENTO

• SE PREPARAN DERIVADOS VOLÁTILES DE CARBOHIDRATOS
• SE INYECTAN EN LA COLUMNA CALIENTE DEL CG
• LOS DERIVADOS VOLÁTILES PSAN A DIFERENTES
  VELOCIDADES A TRAVÉS DE LA COLUMNA CON UNA
  CORRIENTE LEVE DE GAS ACARREADOR

67
CROMATOGRAFÍA DE GASESPROCEDIMIENTO

• LOS COMPONENTES SEPARADOS ALCANZAN EL FINAL DE LA
  COLUMNA Y EL DETECTOR.
• LA SEÑAL GENERADA POR EL DETECTOR CONDUCE A LA
  PLUMILLA DE LA CARTA REGISTRADORA A OBTENER UN
  PICO PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE LA
  SUBSTANCIA.

68
MÉTODOS FÍSICOSDENSIMETRÍA

• FUNDAMENTO
• LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE UNA SOLUCIÓN DE
  AZÚCAR ES UNA FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE
  SOLUTO A UNA TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA
  DE OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA GRAVEDAD
  ESPECÍFICA DE LA SOLUCIÓN, PERO ESTE MÉTODO
  PROPORCIONA UNA APROXIMACIÓN A LA CANTIDA DE
  AZÚCAR PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZÚCAR
  RELATIVAMENTE PURA

69
DETERMINACIÓN PORDENSITOMETRÍA

• EL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN ES UN HIGRÓMETRO
  (TAMBIÉN UTILIZADO PARA MEDIR SÓLIDOS SOLUBLES
  TOTALES).
• SE HA DISEÑADO UN HIGRÓMETRO ESPECIAL PARA LEER
  EL DE AZÚCAR DIRECTAMENTE A 20C (GRADOS BRIX).

70
ÍNDICE DE REFRACCIÓNFUNDAMENTO

• EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR
  ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIÓN.
• LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZÚCARES DE IGUAL
  CONCENTRACIÓN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO
  ÍNDICE DE REFRACCIÓN

71
ÍNDICE DE REFRACCIÓNPROCEDIMIENTO

• SE DETERMINA EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LA
  SOLUCIÓN AZUCARADA A 20C MEDIANTE UN
  REFRACTÓMETRO ABBÉ O UN REFRACTÓMETRO MANUAL.
• SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL DE SÓLIDOS
  SOLUBLES TOTALES (COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE
  ÍNDICES DE REFRACCIÓN A DE SACAROSA COMO
  FACTORES DE CORRECCIÓN.

72
POLARIMETRÍAFUNDAMENTO

• LA RADIACIÓN SE COMPORTA COMO SI TUVIERA UN
  COMPONENTE ELÉCTRICO Y UNO MAGNÉTICO. ACTÚAN COMO
  SI ESTUVIERAN DISPUESTOS EN ÁNGULOS RECTOS UNO
  CON RESPECTO AL OTRO.
• HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN DE LA FUENTE
  LUMINOSA.
• LA DIRECCIÓN DE LOS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y
  MAGNÉTICOS ES PURAMENTE ALEATORIA, ASÍ QUE SE
  TIENE RADIACIÓN NO POLARIZADA.

73
POLARIMETRÍAFUNDAMENTO

• SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN
  ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y
  MAGNÉTICOS EN LA MISMA DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN
  SERÁ POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR
  MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.

74
POLARIMETRÍAFUNDAMENTO

• CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLÉCULA
  ASIMÉTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR
  UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES
  LLAMADO COMPUESTO ÓPTICAMENTE ACTIVO (e.g.
  GLUCOSA).
• SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA LUZ POLARIZADA
  NO SERÁ AFECTADA.

75
POLARIMETRÍAFUNDAMENTO

• EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA
  COMPAGINAR VISUALMENTE LAS SOMBRAS DE UN COLOR.
  ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A
  SU POSICIÓN ORIGINAL.
• SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN REQUERIDO.

76
MAGNITUD DE LAROTACIÓN

• DEPENDIENTE DE
• LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA.
• LONGITUD DE LA CELDA
• NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU
  CONCENTRACIÓN
• TEMPERATURA

77
POLARÍMETROS vs SACARÍMETROS

• POLARÍMETRO USA LUZ MONOCROMÁTICA Y LEE EN
  GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA
  CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR).
• SACARÍMETRO USA LUZ BLANCA Y LEE LA
  CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR DIRECTA.

78
SEPARACIÓN DE PROTEÍNASMÉTODOS

• SE UTILIZAN ESTOS MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE
  ALIMENTOS O INGREDIENTES DE LOS MISMOS.
• PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA DE UN ALIMENTO PARA
  POSTERIOR ESTUDIO EN EL LABORATORIO.

79
SEPARACIÓN DE PROTEÍNASFUNDAMENTO GENERAL

• LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EXPLOTAN
  LAS DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS EN LA SOLUBILIDAD DE
  LAS MISMAS, SU TAMAÑO, CARGA, CARACTERÍSTICAS DE
  ADSORCIÓN, AFINIDAD BIOLÓGICA POR OTRAS
  MOLÉCULAS.
• LAS TÉCNICAS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR PROTEÍNAS
  INDIVIDUALES A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.

80
CONSIDERACIONES GENERALES

• ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA DE SEPARACIÓN DE
  PROTEÍNAS PARA SU PURIFICACIÓN SE DEBE CONOCER
  SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO ISOELÉCTRICO, SUS
  PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE
  DESNATURALIZACIÓN, ALGUNA CARACTERÍSTICA QUE LA
  DISTINGA DE LAS DEMÁS PROTEÍNAS.

81
MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

• LOS MÁS COMÚNES SON
• PRECIPITACIÓN
• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
• CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
• CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO

82
SEPARACIÓN POR CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD
DIFERENCIAL

• FUNDAMENTO
• LA SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN EXPLOTA LAS
  DIVERSAS DIFERENCIAS EN SOLUBILIDAD DE LAS
  PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN.
• LAS PROTEÍNAS SON POLIELECTROLITOS Y SUS
  CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD ESTÁN DETERMINADAS
  POR EL TIPO Y CARGA DE AMINO ÁCIDOS EN LA
  MOLÉCULA.

83
PRECIPITACIÓN DIFERENCIALDE LAS PROTEÍNAS

• CAMBIANDO EL pH DEL BUFFER
• FUERZA IÓNICA
• CONSTANTE DIELÉCTRICA
• TEMPERATURA

84
PROCEDIMIENTOS

• SALADO (SALTING OUT)
• LAS PROTEÍNAS TIENEN PERFILES DE SOLUBILIDAD
  ÚNICOS EN SOLUCIONES DE SAL NEUTRAS.
• LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE SALES NEUTRAS
  AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.

85
SALADO (SALTING OUT)FUNDAMENTO

• SI SE AUMENTA LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN LAS
  PROTEÍNAS SE PRECIPITAN.
• ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS PASOS DE SEPARACIÓN
  DE PROTEÍNAS. ÉSTAS SE PUEDEN SEPARAR DE UNA
  MEZCLA MUY COMPLEJA CON ESTE MÉTODO.

86
SALADO (SALTING OUT)REACTIVOS

• SULFATO DE AMONIO (NH4)2SO4. SE USA COMÚNMENTE
  DEBIDO A QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE.
• TAMBIÉN SE PUEDEN USAR NaCl, O KCl.

87
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICAFUNDAMENTO

• PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). DEFINIDO COMO EL pH AL
  QUE UNA PROTEÍNA NO TIENE CRGA NETA EN SOLUCIÓN.
• LAS PROTEÍNAS SE AGREGAN Y PRECIPITAN EN SU pI
  DEBIDO A QUE NO EXISTE REPULSIÓN ELECTROSTÁTICA
  ENTRE MOLÉCULAS.

88
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICAFUNDAMENTO

• LAS PROTEÍNAS TIENEN DIFERENTES pIS, POR TANTO,
  PUEDEN SER SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA
  SOLUCIÓN.
• CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA SOLUCIÓN AL pI DE
  UNA PROTEÍNA ÉSTA PRECIPITA. SI LAS DEMÁS
  PROTEÍNAS TIENEN OTROS pIS ÉSTAS PERMANECERÁN EN
  SOLUCIÓN

89
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNASPOR TAMAÑO

• FUNDAMENTO
• LOS PESOS MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS SON
  DE 10 000 A MÁS DE 1 000 000. POR TANTO, EL
  TAMAÑO ES UN PARÁMETRO A EXPLOTAR PARA SU
  SEPARACIÓN.
• LA SEPARACIÓN REAL OCURRE BASADA EN EL
  LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES EL RADIO
  PROMEDIO DE LA PROTEÍNA EN SOLUCIÓN Y ES
  DETERMINADO POR LA CONFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA.

90
PROCEDIMIENTOSDIÁLISIS

• FUNDAMENTO
• SE UTILIZA PARA SEPARAR MOLÉCULAS EN SOLUCIÓN
  MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS SEMIPERMEABLES QUE
  PERMITEN EL PASO DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS PERO NO DE
  LAS GRANDES.

91
DIÁLISISPROCEDIMIENTO

• LA SOLUCIÓ PROTÉICA ES COLOCADA EN UN TUBO O
  BOLSA DE DIÁLISIS QUE SE AMARRA O SUJETA POR UN
  EXTREMO.
• EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA VEZ QUE SE
  HA COLOCADO LA MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O
  BOLSA EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER
  (GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MÁS GRANDE QUE LA
  CANTIDAD DE MUESTRA EN EL TUBO O BOLSA DE
  DIÁLISIS.

92
DIÁLISISFUNDAMENTO

• LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR DIFUNDEN FUERA
  DEL TUBO DE DIÁLISIS.
• EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA ADENTRO DEL TUBO.
• LA SOLUCIÓN PROTÉICA DE ADENTRO DEL TUBO A MENUDO
  ES DILUIDA DURANTE LA DIÁLISIS DEBIDO A
  DIFERENCIAS EN FUERZA OSMÓTICA ENTRE LA SOLUCIÓN
  Y EL AGUA O BUFFER DE LA DIÁLISIS

93
APLICACIONES DEL MÉTODO DE DIÁLISIS

• SE PUEDE UTILIZAR ESTE MÉTODO PARA CONCENTRAR
  PROTEÍNA ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DIÁLISIS CON
  POLIETILENGLICOL, EL CUAL ABSORBE AGUA Y
  CONCENTRA LA SOLUCIÓN DENTRO DE LA BOLSA DE
  DIÁLISIS.
• EL EQUILIBRIO DE LA DIÁLISIS SE PUEDE USAR PARA
  DETERMINAR LA ESTEQUIOMETRÍA DE LA UNIÓN
  PROTEÍNA-LIGANDO.

94
GELIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

• CASO DE LA CASEÍNA DE LA LECHE
• FUNDAMENTO
• EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA LECHE,
  BÁSICAMENTE UN GEL DE CASEÍNA .

95
FORMACIÓN DE LA CUAJADA

• SE BASA EN LA ACIDIFICACIÓN DE LA LECHE MEDIANTE
  ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.
• LAS ENZIMAS ACTÚAN EN UN RANGO ÓPTIMO DE 36-39ºC.
• SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE QUIMOSINA Y
  PEPSINA DE CERDO CON UNA ENZIMA COAGULADORA
  OBTENIDA DE UN HONGO.

96
FORMACIÓN DE LA CUAJADA

• LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN LA CONVERSIÓN
  DE LAS MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE CALCIO
  DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN EL QUESO.
• LAS MICELAS DE CASEÍNA EN LA LECHE PUEDEN
  DESESTABILIZARSE POR LA ENZIMA QUIMOSINA. ÉSTA ES
  EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS GOTAS O TABLETAS DE
  CUAJO.

97
EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIÓN DEL QUESO

• LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA PRIMERA ETAPA
  EN LA COAGULACIÓN DE LA LECHE.
• CAUSA LA DIVISIÓN DE UN ENLACE ESPECÍFICO, EL
  ENLACE PEPTÍDICO DE FENIL-ALANINA-METIONINA.
• ROMPE LA PORCIÓN ÁCIDA RICA EN CARBOHIDRATOS DE
  LA MOLÉCULA DEL RESTO HIDROFÓBICO PRIMARIO O
  para-k- CASEÍNA.

98
EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIÓN DEL QUESO

• CON LA PÉRDIDA DE LA PORCIÓN ÁCIDA DE LA
  MOLÉCULA, EL RESTO DE LA k-CASEÍNA YA NO
  ESTABILIZA LAS MICELAS. ÉSTAS SE APROXIMAN UNAS A
  OTRAS Y SE UNEN, PROBABLEMENTE POR ENLACES
  HIDROFÓBICOS Y FORMAN UNA RED TRIDIMENSIONAL QUE
  ATRAPA LA FASE ACUOSA DE LA LECHE.

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EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIÓN DEL QUESO

• LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL CALCIO DE LA MICELA.
  EL COAGULO DE LA LECHE FORMADO POR LA ACCIÓN DEL
  CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO DE CALCIO.
• EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES FIRME, ELÁSTICO.

100
TEMPERATURA ÓPTIMA DEFORMACIÓN DE LA CUAJADA

• 39-40ºC
• LA LECHE NO DEBE SOBRECALENTARSE ANTES DE AÑADIR
  EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA GEL ÉSTE SERÁ
  DÉBIL DEBIDO, EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO
  POR EL CALOR ENTRE LA
• ß-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASEÍNA. ÉSTA ÚLTIMA SE
  HACE RESISTENTE AL EFECTO DE LA QUIMOSINA.

101
(No Transcript)