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FISICOQUIMICA Curso 2004 Clases Teórica
36 Noviembre 17
LA PRODUCCION DE ENERGIA UTIL EN LOS MAMIFEROS
LA FOSFORILACION OXIDATIVA MITOCONDRIAL
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Mecanismo de transducción de energía en los
animales

• Los seres vivos son máquinas químicas que
  utilizan la energía química del ATP para hacer
  espontáneas a las reacciones endergónicas
• La energía química de los sustratos que se oxidan
  se utilizan para la generación de un gradiente
  electroquímico de H en la membrana mitocondrial
• El gradiente electroquímico de H se utiliza para
  la producción de ATP.

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Las mitocondrias, esas organelas subcelulares
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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO MITOCONDRIAL
EFECTO DEL ADP
ADP

• El ADP aumenta el consumo de O2
• La relación
• con ADP/sin ADP
• (est. 3/est. 4)
• es denominada Control Respiratorio

DO2 Dt
El control respiratorio, usualmente de 4 a 10,
es el índice mas sensible para juzgar la
integridad y el acoplamiento mitocondrial y, por
lo tanto, la calidad de las mitocondrias
aisladas.
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Consumo de oxígeno energía biológica

• El 95 del oxígeno consumido se consume en las
  mitocondrias
• El 99 del oxígeno consumido por las
  mitocondrias es reducido por la citocromo oxidasa
• El 100 del oxígeno consumido por la citocromo
  oxidasa se utiliza para sintetizar ATP por el
  mecanismo conocido como fosforilación oxidativa

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO CELULAR
CONCEPTO CLÁSICO ADP ______________ O2 no es
limitante O2 celular 5-30 mM O20.5 para la
respiración mitocondrial 0.02-0.3 mM

• NUEVO CONCEPTO
• ADP
• O2
• NO

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO MITOCONDRIAL
TRES PROTEINAS REGULAN LA
RESPIRACION 1. La F1-ATPasa (factor limitante
ADP) 2. La mtNOS (produce NO) 3. La citocromo
oxidasa (factor limitanteNO/O2)
F1-ATPasa
ATP
NADH
2 H
2 H
ADP
2 H
2 H
O2 NO
mtNOS
Citocromo oxidasa
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Ensayo polarográfico estándar para acoplamiento
mitocondrial

• La respiración se mide en natg O/min/mg prot.
• Respiracion en estado 4a Respiración
  controlada, definida por el flujo pasivo de
  protones a través de la membrana interna.
• Respiración en estado 3 Respiración activa, la
  máxima velocidad fisiológica de consumo de O2 y
  de síntesis de ATP.
• Respiración en estado 4b. Idem 4a. Cuando es
  mayor que 4a implica activación de la ATPasa
  mitocondrial por desacoplamiento o exceso de
  Mg2.
• Control respiratorio (1 y 2) Las relaciones
  entre las respiraciones en est. 3/ est.4a y est.
  3/ est.4b. Normalmente, de 3 a 7 con succinato y
  de 4 a 10 con malato-glutamato.
• Relación ADP/O Mide la fosforilación oxidativa.
  Normalmente, 1.7 con succinato y 2.7 con
  malato-glutamato.

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(No Transcript)
10
(No Transcript)
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Reacciones de los complejos mitocondriales

• Complejo Reacción DE
• I NADH2 gt UQ 260 mV
• II Succ gt UQ 0 mV
• III UQH2 gt cit. c 200 mV
• IV cit c gt O2 620 mV

Las diferencias de potencial eléctrico de mas de
200 mV, definen los sitios de conservación de
energía. Se toma un DEde 0.23 V como potencial
operacional para la conservación (transducción)
de energía.
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La cadena respiratoria mitocondrial (2002)
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La cadena respiratoria mitocondrial
NADH2 gt Fp(FMN) gt UQ gt cit bKbTgt cit c,c1gt
cit aa3 gtO2

• Una serie de moléculas con grupos prostéticos
  redox con potenciales de oxidación crecientes
  desde el NADH2 (-320 mV) al O2 ( 820 mV) y DE
  1.14 V.
• La oxidación del NADH2 por el O2 genera 220 kJ/2
  e- (DG -nF DE -2 x 96500 x 1.14).
• Las reacciones de transferencia de electrones
  (óxido-reducciones) se realizan a alta velocidad
  por estar los transportadores de electrones
  incorporados en la membrana interna y
  restringidos en sus movimientos .

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Los potenciales redox (E) de los componentes de
la cadena respiratoria

• NADH2 - 320 mV
• FMNH2 - 280 mV
• Fe-S (Complejo I) - 270 mV
• FADH2 - 10 mV
• Fe-S (Complejo II) 20 mV
• Ubiquinol (UQH2) 60 mV
• Citocromo bk 40 mV
• Citocromo bT 190 mV
• Citocromo c (c1) 230 mV
• Citocromo aa3 380 mV
• Oxigeno 820 mV

Los de mas arriba en la tabla reducen a los de
mas abajo
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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La teoría quimiosmóticamitocondrial(Mitchell,
1965)

• La membrana interna es impermeable a los H.
• La transferencia de electrones en la cadena
  respiratoria produce la extrusión vectorial de H
  al citosol.
• A ambos lados de la membrana interna
  mitocondrial se establece un potencial
  protomotriz (Dp 60 DpH Dj).
• El potencial electroquímico de los H determina
  su pasaje por la F1-ATPasa y la síntesis de ATP.

10 H
2e-
NADH O2
ATP ADP
3 H
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(No Transcript)
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Teoría Quimiosmótica (Mitchell, 1962-1978)
H
Formulación del potencial electroquímico del H
en la matriz mitocondrial (1) y en el espacio
intermembranas (citosol) (2)
2
1

• ?m(2-1) RT ln (aH(2)/ aH(1) F.??(2-1)
• ?

Dividiendo por F, y tomando ?p ?m/F y pH
-log aH
?p ?? 59 ?pH
La fuerza protomotriz (?p), expresa en mV
(normalmente 220 mV) el potencial electroquímico
del H que es utilizado en la síntesis
endergónica de ATP a partir de ADP y Pi.
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La teoría quimiosmótica ?p ?? 59
?pHDeterminación experimental

• Determinación de Dp en mitocondrias en estado de
  reposo (estado 4)
• Dp Df 60DpH
  
• 220 mV 50 mV
  170 mV

En mitocondrias respirando, el pH de la matriz ?
8.0, para un pH del citosol ? 7.2
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Consideraciones energéticas para cada sitio de
conservación de energía (1)

• DG - n . F. DE
• para 2 e- (reacción redox) y H (F1-ATPasa)
• DG - 2 x 96500 x 0.23 - 44.3 kJ/2 H
• ADP Pi gt ATP DG 32.6
  kJ/mol
• Reacción redox (DE 0.23 V) DG -
  44.3 kJ
• Reacción total acoplada DG - 10.8
  kJ/mol

Eficiencia (química redox /química
fosforilación) 32.6/44.3 74
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(No Transcript)
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• ADP Pi ATP DG 32.6
  kJ

El flujo de H por dentro de la proteína de la
F1-ATPasa (un rotor molecular) produce la
síntesis de ATP a partir de ADP y Pi
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(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
(No Transcript)
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• (1) La reacción redox
• NADH2 ½ O2 gt NAD ½ H2O DG -
  220 kJ
• DE 0.82 - (- 0.32) 1.14 V
• DG - n . F . DE ( - 2 x 96500 x 1.14) - 220
  kJ
• (2) La fuerza protomotriz (el potencial
  electroquímico del H)
• 220 mV (medido) para 10 H)
• DG - n . F . DE ( - 10 x 96500 x - 0.22) 212
  kJ
• Eficiencia (Dp / DE) 212 /220 96
• (3) La síntesis de ATP
• ADP Pi gt ATP
  DG 32.6 kJ
• para 3 H por vuelta del rotor de la F0
• DG - n . F . DE ( - 3 x 96500 x 0.22) - 63.7
  kJ
• Eficiencia 32.6/ 63.7 51

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FRACCION DE LA MASA MITOCONDRIAL EN ESTADOS 4 Y 3
EN ORGANOS PERFUNDIDOS

• --- Consumo de oxígeno ---
• Mitocondrias Organo
  Contenido de Fracción de
• est. 4 est. 3 perfundido
  mitocondrias mitocondrias
  (nmol O2/min/ (mmol O2/min/ (mg prot./
  est. 4 est. 3
• mg prot.) g órgano) g
  órgano) ---- ( ) ----
• Hígado 10 88 1.3 35 65 35
• Corazón 28 135 3.1 53 72
  28

La fracción de mitocondrias en estado 3 (x), se
calcula de Consumo del órgano/contenido de
mitocondrias (1-x) est. 4 (x) est. 3
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REGULACIÓN DEL SUMINISTRO DE OXÍGENO POR EL ÓXIDO
NÍTRICO. 1. El efecto vasodilatador.

• El NO generado por la eNOS del endotelio vascular
  activa a la GMP ciclasa del musculo liso, aumenta
  el cGMP, y produce vasodilatación. El aumento
  del diámetro de los vasos, permite un mayor
  tiempo de equilibración y aumenta la liberación
  de O2 de la HbO2 a los tejidos.
• Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1998 a
  Forschgott, Murad e Ignarro por su
  descubrimiento del papel de mensajero
  intercelular del NO en el sistema cardiovascular

Mensajero intercelular
Vasodilatación endotelio-músculo liso
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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO POR EL ÓXIDO
NÍTRICO. 2. Inhibición de la citocromo oxidasa
por el NO
Inhibición competitiva con el O2 depende de la
relación O2/NO 150 O2 1 NO
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Competición en el centro activo de la citocromo
oxidasa
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OXIDO NITRICO SINTASA MITOCONDRIAL (mtNOS) el
descubrimiento

• La actividad de mtNOS, determinada como
  producción de NO, fue original y simultáneamente
  observada en mitocondrias de hígado de rata por
  Ghafourifar y Richter (1997) y por Giulivi,
  Poderoso y Boveris (1998).
• Previamente se había informado la existencia de
  una proteína mitocondrial reactiva con
  anticuerpos anti-eNOS (Kobzik et al. (1995) y
  Bates et al. (1995 1996).

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LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LA mtNOS EN LA
REGULACION DE LA RESPIRACION DE MITOCONDRIAS DE
HIGADO DE RATA. Efectos del sustrato (arginina)
y de un inhibidor (NMMA).

• Respiración en estado 3
  (ng-at O/min.mg prot.) ()
• malato-glutamato con ADP 113 84
• (a) id. 0.3 mM arginina 101 75
• (b) id. 1 mM NMMA 135 100
  
• Actividad functional de la mtNOS (b-a) 34
  25
• succinato con ADP 178 87
• id. 0.3 mM arginina 160 78
• id. 1 mM NMMA 205 100
• Actividad functional de la mtNOS (b-a)
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