Prcticas de Organografa animal

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Prácticas de Organografía animal

• Curso académico de 2006/07

Titulares -Profesor responsable Pedro Del
Castillo, despacho A114b, teléfono 91-497-8238,
e-mail pedro.delcastillo_at_uam.es -Magdalena
Cañete, despacho A115, teléfono 91-497-8236,
e.mail magdalena.canete_at_uam.es Ayudante -Mª
Teresa Parra Catalán, despacho A103,5B, teléfono
91-497-2660, e-mail mayte.parra_at_uam.es
Esta presentación ha sido realizada por la Dra.
María Teresa Parra Catalán
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Objetivo de la práctica Realización de técnicas
básicas de procesamiento histológico de tal
manera que el estudiante se familiarice con los
principios generales que sustentan dichas
técnicas.
Procesamiento histológico Realización un
corte delgado de un fragmento de órgano fijado,
que después se tiñe, se monta sobre un
portaobjetos mediante un medio de índice de
refracción adecuado, y finalmente se cubre con un
cubreobjetos para su observación microscópica.
Evaluación A la finalización de las mismas el
alumno deberá entregar un preparado realizado
durante las mismas. También deberá entregar un
cuaderno de prácticas. Así mismo, rellenará un
cuestionario con preguntas sobre los principios
que sustentan los diferentes pasos realizados en
el procesamiento histológico realizado.
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El microtomo de prácticas
El micrótomo es un instrumento mecánico de
precisión que se utiliza para obtener secciones,
suficientemente delgadas, de órganos animales o
vegetales que permitan su posterior visualización
a través del microscopio.
El micrótomo de prácticas es de rotación. Como
consecuencia se pueden obtener secciones delgadas
y seriadas del material biológico pertinentemente
incluido
El micrótomo no se debe mover nunca del lugar en
el que está situado. La caja no se debe abrir sin
estar presente el profesor de prácticas.
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El microtomo de prácticas
Leer atenta y detenidamente la descripción e
instrucciones de uso del microtomo
-La base sirve para sustentar al micrótomo en la
mesa. -La caja, o carcasa, aloja el sistema
mecánico de engranajes de precisión y el
mecanismo para seleccionar el espesor de
sección. -La manivela está situada a la derecha
del aparato. Consiste en un volante con una
manija y un freno. En el volante hay pintada una
flecha que indica la dirección en la que se debe
mover la manivela. -El freno es un tornillo
que accionándolo hacia afuera y girándolo sobre
si mismo un cuarto de vuelta liberará la
manivela. -El brazo portabloques es donde se va
a situar la porción de material biológico
incluida en parafina.. Consta de una mordaza, una
rótula que es controlada por su freno y dos
tornillos de regulación. El tornillo de la
mordaza, cuya cabeza es de color negro, sujeta el
bloque al portabloques. El freno es el tornillo
cuya cabeza es de menor tamaño se acciona en
sentido horario o antihorario para liberar la
rótula del portabloques. Además hay dos tornillos
de regulación horizontal y vertical, para poder
orientar el sentido del corte. Para accionar
estos dos últimos es necesario liberar la rótula
del portabloques por acción del freno, una vez
orientado el bloque el freno debe volver a la
posición de frenado. El brazo portabloques se
mueve hacia arriba y abajo, mientras que aproxima
el bloque a la cuchilla, por acción de la
manivela. Tal movimiento tiene como objetivo la
obtención de cortes de espesor delgado además de
ser seriados.
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El microtomo de prácticas
-El portacuchillas es el elemento que va a
sujetar la cuchilla al micrótomo. Está situado
frente al observador, sujeta a la base del
micrótomo, delante del portabloques. Consta de
los tornillos de sujeción de la cuchilla (en
número de cuatro con las cabezas de color negro),
de un tornillo aproximador ( grande y metálico
situado a la izquierda). La palanca que controla
el ángulo de corte está situada a la derecha, y
es accionada previa liberación de su freno
(tornillo pequeño y metálico situado en el sector
circular de la palanca). La palanca de ángulo de
corte posee una escala de grados, entre 0 a 10º
la posición inicial a la que se debe trabajar es
aproximadamente a 5º que indica que el filo de
la cuchilla esta situado a 5 grados hacia dentro
respecto a la vertical. El micrótomo de
prácticas estará provisto de cuchillas para su
utilización en caso de tener que cambiarlas se
requerirá la presencia del profesor de prácticas
para que monte el sistema de cuchillas. Las
cuchillas no deben ser manipuladas por lo
alumnos así como, no se deben limpiar con
instrumentos metálicos, tales como agujas
enmangadas etc. Si fuera necesario limpiar el
filo de la cuchilla siempre se hará con un pincel
fino procurando no tocar el filo. -La manivela
de recuperación del avance del brazo portabloques
está situada a la izquierda del micrótomo. Una
vez utilizado el micrótomo, es conveniente
hacerle volver a la posición de inicio. Para ello
se acciona la manivela en sentido antihorario
hasta que la base del brazo portabloque esté
cercano a la caja de engranajes.
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Realizar cortes
-Colocar el bloque anteriormente desbastado en el
portabloques del microtomo, orientándolo
bien. -Se aproxima el portacuchillas al extremo
del bloque de parafina, sin que cuchilla y bloque
se toquen, pero suficientemente cercanos, y se
asegura el portacuchillas con su freno. -Se
selecciona el espesor de corte a 20 ?m. -Se
desbloquea el freno del volante y girando éste en
sentido horario se aproximará la cuchilla y el
bloque de parafina. -Se comienza a cortar
procurando que el movimiento sea con periodo
constante. Los primeros cortes se rizarán encima
del borde de la cuchilla, con el pincel se
recogerán y se desechan. Se observará que el
frente de corte del bloque brilla como un
espejo. -Se vuelve a seleccionar en el espesor
de corte ahora a 7 ?m y se seguirá cortando
hasta que los cortes salgan enteros y uno detrás
de lo otro. -Con ayuda de un pincel, se irán
estirando suavemente los cortes recién hechos
hasta conseguir una ristra, que se mantendrá en
horizontal y se irá separando de la cuchilla a
medida que vayan saliendo los cortes. - Cuando
la ristra tenga suficientes cortes se detiene el
movimiento del micrótomo con el pincel y una
aguja enmangada se separará de la cuchilla y,
con cuidado de que ni se caiga o se arrugue, se
depositará sobre una cartulina negra, paralelas
entre sí, sin que se peguen las unas con las
otras. Teniendo la precaución de que el lado
céreo del corte quede en contacto con la
cartulina, pero sin que se pegue a ella.
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Recolección de muestras
-Los órganos se recolectan por disección de
animales de laboratorio Recomendaciones para la
Eutanasia de los animales de Experimentación.
Laboratory Animals 30,293-316 (1996) y 31,1-32
(1997).
-Se lavan en PBS (solución tamponada de fosfato)
-Se trocean con bisturí en porciones adecuadas
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Fijación
Utilizaremos dos tipos de fijación química
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Fijación
30 minutos
Mantener en el fijador durante 24 h a 4ºC.
Lavar para extraer el exceso de fijador
Fijaciones en Formaldehído lavar durante 60
minutos en agua destilada
Fijaciones en Bouin lavar en agua corriente
(hasta que el agua deje de ser de color amarillo,
usualmente después de 24 h).
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Almacenamiento de las muestras
Requiere una deshidratación parcial, ya que si se
dejaran en la solución de fijación se extraerían
componentes tisulares y el órgano se endurecería
demasiado
Deshidratación parcial
Pasar por soluciones de etanol/agua destilada de
menor a mayor concentración en alcohol, para que
este sustituya al agua en la muestra
En una probeta de 100 ml se depositan X ml de
etanol absoluto y se completa con agua destilada
hasta enrasar a 100 ml. El resultado es una
solución de X .
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Inclusión
Rodear las piezas de un material suficientemente
rígido como para poder ser cortardas en secciones
de poco espesor (aproximadamente entre 3 y 7 µm)
Como medio de inclusión utilizaremos parafina o
Paraplas plus (mezcla de parafina y plástico),
ambas hidrofóbicas
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Inclusión
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Inclusión
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Inclusión
2º Infiltrar-
El material se pondrá en una mezcla de Parafina y
n-Heptano a partes iguales que estará en estufa a
temperatura de fusión del medio de inclusión, en
el caso del Parafina a 56º C.
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Confección del bloque
Las pinzas pinzas Leuckart y placa de metal, las
pinzas finas y la parfina han de estar al punto
de fusión del medio de inclusión (en estufa)
Pinzas Leuckart Son dos piezas metálicas que al
unirse forman un prisma
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Confección del bloque
Dejar que el bloque alcance la temperatura
ambiente, para que solidifique. Desprender el
bloque del molde y dejarlo en agua a temperatura
ambiente unas horas. Dejar secar el bloque al
aire.
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Preparativos antes de cortar
Preparación de portaobjetos Los portaobjetos han
de ser tratados con unja sustancia que actué como
pegamento para los cortes que depositaremos.
Utilizaremos albúmina de Meyer.
Albúmina de Meyer Procedimiento para preparar 5
tubos de 2ml En una probeta de 10 ml poner una
solución de cloruro sódico al 0,5 , añadir 0,5
gramos de Albúmina de huevo, con ayuda de una
varilla de vidrio limpia mezclar la solución con
la albúmina (sin agitar realizando movimientos
circulares con la varilla, si se agita se formará
espuma que no es deseable). Con ayuda de papel de
filtro y un embudo filtrar la solución. Mezclar a
partes iguales la solución anterior con glicerol
y volver a mezclar sin hacer espuma. Separa la
solución en tubos de 2 ml y almacenar a 4º C. La
solución debe extenderse sobre los portaobjetos a
temperatura ambiente.
Poner una gotita de albúmina, con ayuda de el
mango de una aguja enmangada o un palillo, en uno
de los extremos de un portaobjetos. Extenderla
con el con movimientos rápidos y frecuentes hasta
que la superficie del portaobjetos esté
prácticamente seca. Los portaobjetos así
tratados se dejarán secar al aire en un lugar sin
polvo, hasta el día siguiente. Tardan una noche
al menos en secar
Gotita de albumina
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Preparativos antes de cortar
Tallado del bloque Se ha de tallar el bloque de
Parafina con la muestra para facilitar su
posterior corte
Cortar con ayuda de un cuchillo caliente la
porción donde está localizada la muestra
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Individualizar y estirar cortes
Ristra de cortes
Separarlos con un pincel, aguja enmangada o
bisturí.
Primer corte de la ristra
En ambos casos, se escurre el agua y se dejan
secar
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Tinción de preparaciones histológicas
Para teñir los cortes utilizaremos cubetas de
tinción así podremos trabajar con un número
elevado de portaobjetos a la vez
Introducir varios portaobjetos con los cortes
pegados y secos. Cuidado que queden separados y
no se peguen las muestras.
El cestillo se pasará de una cubeta a otra sin
mover los portaobjetos
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Tinción de preparaciones histológicas
Desparafinar e hidratar los cortes
Para poder teñir los cortes es necesario
despojarlos del medio de inclusión, Paraplast
plus y, como el solvente de las soluciones de
coloración es el agua, hay que hidratarlas
siguiendo el protocolo
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Tinción de preparaciones histológicas
Hematoxilina / Eosina Tinción recomendada para
órganos animales, fijados en formol y puede ser
utilizada para los fijados en Bouin y otros
fijadores.
Preparación de colorantes
HEMATOXILINA DE HARRIS A-1 gramo de
Hematoxilina (Certistain) MERCK CL 75290 en 10
ml. de Alcohol absoluto (de melaza) y disolver
bien. B- 20 gramos de sulfato de Aluminio y
Potasio (Alumbre de Aluminio y Potasio) MERCK en
200 ml. de agua destilada, y disolver bien. C-
0,5 gramos de HgCl2 (Cloruro de mercurio, RIADEL
DE HAËN, A6). Método para hacer la solución 1º -
Poner B en una estufa, hasta que esté
caliente. 2º - Añadir la solución A 3º - Añadir
la solución C. 4º - Cuando todo esté en
ebullición, retirar de la estufa. 5º - Enfriar
con agua corriente. 6º - Dejar reposar durante 24
horas. 7º - Filtrar. 8º - Probar.
EOSINA Eosina Y (C.I.45380). . . . . . . .
2.5g. Agua destilada . . . . . . . . . . .
495ml. Ácido acético glacial. . . . . . . . .
5ml. (Ésta solución es útil hasta unos meses y
puede reutilizarse muchas veces. De vez en cuando
conviene filtrarla. Se puede añadir un cristal de
timol para evitar el crecimiento de hongos.
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Tinción de preparaciones histológicas
Hematoxilina / Eosina
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Tinción de preparaciones histológicas
Tricrómico de Masson Tinción recomendada para
órganos animales, fijados en Bouin y otros
fijadores. Se denomina tricrómico por los colores
resultantes, a pesar de que se emplean cuatro
colorantes.
Preparación de colorantes
HEMATOXILINA FÉRRICA DE WEIGERT Solución
A Hematoxilina. . . . . . .1,2gr. Etanol
absoluto. . . .104,5ml. Solución B Cloruro
férrico al 30 en agua. . . . .4m. ácido
clorhídrico. . . . . . . . . . . . . . .
1ml. agua destilada. . . . . . . . . . . . . . .
. . 95ml. Preparar ambas soluciones es stock y
mezclar solamente en el momento de teñir, en una
proporción 11. Hacer un volumen aproximado de
2ml. por preparado.
FUCSINA ÁCIDA-PONCEAU Solución A Fucsina ácida
. . . . . 1gr (RubinS) Ácido acético. . . . .
0,5ml. Agua destilada . . 100 ml. Solución
B Xilidil-Ponceau..1gr. Ácido
acético.0,5ml. Agua destilada100ml.
Preparar las soluciones es stock y mezclar en
el momento de teñir, en una proporción de 1 parte
de A y dos de B.
ORANGE G Ácido fosfomolíbdico. . . . . .
.2,5gr. Agua destilada. . . . . . . . . .
100ml. Orange g. . . . . . . . . . . . . . .
2gr.
VERDE LUZ Verde luz SF amarillento. . . . .
1gr. Ácido acético Glacial . . . . . . .
.1ml. agua destilada. . . . . . . . . . . .
.99ml.
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Tinción de preparaciones histológicas
Tricrómico de Masson
Preparado quedará negro
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Tinción de preparaciones histológicas
Tricrómico de Masson
Verde luz 25
30 seg.
Preparado quedará verde
Lavar Hasta que el cristal quede limpio. No secar
las preparaciones. Estas han de permanecer en
agua hasta su posterior montaje.
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La fucsina ácida Ponceau preferencialmente tiñe
estructuras básicas en tonos ROSADOS
El balance entre los colores es una decisión
personal, hay gran variabilidad en los colores.
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Limpieza y montaje en definitivo
Limpieza de las preparaciones después de la
tinción Una vez concluido el proceso de tinción
los preparados deben limpiarse con ayuda de un
papel de filtro con objeto de que no haya trazas
de colorantes en los portaobjetos, que contienen
albúmina y que es susceptible de teñirse. Esta
operación se debe realizar con rapidez antes de
que la sección se seque.
Montaje de las preparaciones no permanentes o
semipermanentes
Presionar para que salga el exceso de líquido
Agua destilada, ácido acético 50, ácido láctico
50, glicerol 50 en agua destilada, o en algún
tampón, etc.
Colocarlo bocabajo
Poner un cubreobjetos
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Limpieza y montaje en definitivo
Montaje de las preparaciones permanentes Para
realizar una preparación permanente es necesario
conocer el medio de montaje y su comportamiento
con el tiempo. Si el medio de montaje que se va a
utilizar es hidrófobo, antes de emplearlo es
necesario deshidratar la sección inmediatamente
después de la tinción.
Todos han de ser pases rápidos
Permanecerán en n-Heptano hasta su montaje
definitivo. No dejar secar.
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Limpieza y montaje en definitivo
Montaje preparación permanente
Presionar para que salga el exceso de líquido y
burbujas
DePex o Eukitt
Colocarlo bocabajo
Poner un cubreobjetos
Dejar secar al aire
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Etiquetado de las preparaciones histológicas
El proceso de etiquetado es imprescindible una
vez que comprobemos que la preparación es buena y
que se va a guardar. Así siempre tendremos toda
la información necesaria para poder analizar la
muestra en cualquier momento y en cualquier lugar
La etiqueta deberá reflejar El órgano de que se
tata. La especie de la que procede. El tipo de
fijador. El procedimiento de inclusión si lo
hubiera. El procedimiento de coloración. El tipo
de montaje. El nombre de la persona, o la
institución, que lo ha confeccionado. La fecha de
confección.
Las preparaciones se almacenan en cajas
apropiadas, en un lugar seco y fresco, a ser
posible en oscuridad.