Diapositiva 1

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Cultivo celular
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• Modelo de laboratorio para cultivo celular
• Objetivo Proteger al operador y al producto
• Tener en cuenta
• diseño
• ubicación
• equipamiento
• entrenamiento del personal encargado

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Areas del laboratorio
Area estéril o de cultivo - cámaras de flujo
laminar o cerradas con UV - sin corriente de
aire - filtros de aire - desinfecciones
periódicas - luz UV en períodos de descanso -
área, equipos y materiales sólo para cultivo
celular Incubación - estufas humidificadas a
37C, gaseadas con CO2 - cuartos
termostáticamente controlados Preparación -
filtración de los medios en cámaras de flujo
laminar - pHímetro y agitador magnético -
guantes, barbijo y guardapolvo Almacenamiento -
tanques de N2 Lavado y esterilización -
preparación del material lejos del área de cultivo
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Equipamiento

• Cabina de flujo laminar
• Centrífugas refrigeradas (hasta 2000rpm)
• Microscopio o lupa invertida (hasta 100X)
• Equipos de esterilización
• Equipos para filtrar medios
• Tanques de almacenamiento de células
• Heladera y freezer
• Estufas con y sin CO2
• Fuentes de agua destilador, desionizador, etc.
• Baños termoestabilizados
• Balanzas, pHímetro, agitador magnético, pipetas
  automáticas, etc.
• Materiales probetas, pipetas, botellas,
  frascos de cultivo cámara de Neubauer, etc.

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Equipamiento
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Material estéril
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Material estéril
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Cámara de flujo laminar
Función proteger al operador, producto y medio
ambiente. Características principales Aire
filtrado estéril (HEPA) y régimen de aire
laminar. Los filtros HEPA retienen con un
99.97 de eficiencia las partículas de hasta 0.3
micrones. Clasificación según el nivel de
bioseguridad que ofrezcan La elección del nivel
de bioseguridad depende de la peligrosidad del
material de experimentación.
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• Esterilización proceso por el cual se eliminan
  totalmente los microorganismos de un objeto o
  sustancia
• Autoclave 121C, por lo menos 20 min. a 1.2
  atm., para soluciones, plásticos o vidrio con
  tapón de algodón
• Calor seco 180C, por lo menos 2 Hs., para
  vidrio
• Filtración las bacterias y virus se eliminan
  con filtros con poros de 0.22?m, soluciones
  lábiles al calor (ej. Medios de cultivo)
• Óxido de etileno y radiaciones ionizantes son
  menos frecuentes

Desinfección proceso por el cual se detiene el
desarrollo celular de los microorganismos,
elimina la mayor parte de éstos pero no sus
esporas.
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Tejido u órgano
Disgregación mecánica, enzimática o por tamices
Cultivo primario 1er cultivo in vitro Conserva
cariotipo característico del organismo que le dio
origen
Subcultivo línea celular Primeros pasajes
conserva células y cariotipo del organismo de
origen
Línea celular continua 1 tipo celular, diploide
? 50 generaciones
Línea celular continua establecida 1 tipo
celular, aneuploide teóricamente infinitas
generaciones
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Tiempo generacional Tiempo que tardan las células
de un cultivo en duplicarse Tipo de crecimiento
celular Células Monocapa capa de células
crecidas sobre una superficie ? células que para
crecer necesitan una superficie de adhesión
? morfología de fibroblasto o
epitelial Suspensión crecen en medio líquido ?
hematopoyéticas, transformadas o de tumores
malignos ? morfología redondeada Cultivos en
masa obtención de células a gran escala,
biotecnología ? botellas roller, microcarriers,
tanques fermentadores, reactores de fibra hueca,
etc.
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• Requerimientos del crecimiento celular
• Requerimientos nutricionales
• Medios de cultivo composición de nutrientes
  esenciales balanceados cuantitativamente
• - aa síntesis de proteínas y Ac. Nucléicos
• - H de C fuente de energía
• - iones inorgánicos
• - vitaminas, etc.
• Suero composición no cuantitativa de diferentes
  componentes con actividad promotora del
  crecimiento celular
• Requerimientos fisiológicos
• Temperatura ( 37C)
• pH óptimo (7.2-7.4)
• CO2 (5)
• Presión osmótica
• Humedad cercana a saturación

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Tipos de medios de cultivo Definido (sin suero)
composición química y concentración perfectamente
determinados. Medio solo o con agregado de
formulaciones especiales. Ej ? MEM medio
esencial mínimo, 27 factores esenciales para el
crecimiento celular ? DMEM medio esencial
mínimo modificado, 4 veces ? vit., aa no
esenciales, etc. ? HamF12 MEM albúmina,
transferrina, insulina y piruvato de sodio
No definidos (con suero o hidrolizados
proteicos) tienen componentes cuya composición
química y concentración no están
determinados. Ej ? Medios de mantenimiento
células con metabolismo basal MEM / RPMI 2
suero ? Medios de crecimiento activación
del ciclo celular MEM / RPMI 10 suero
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• Técnicas generales de cultivo celular
• Mantenimiento de los cultivos
• Cambios periódicos del medio ( ? pH, agotamiento
  nutrientes, por crecimiento celular, etc.)
• Volumen del medio
• Subcultivos (antes de que el cultivo entre en
  meseta)
• Viabilidad celular
• Cámara de conteo o hemocitómetro Cámara de
  Newbauer (error del 10), utilización de
  colorantes vitales y no vitales
• Contador electrónico o Coulter
• Clonado celular
• Método que permite el aislamiento de 1 célula y
  su posterior propagación
• Ej Dilución límite

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Preservación celular Congelación Objetivo
conservar células por largos períodos, disminuir
el riesgo de contaminación y probabilidad de
pérdida de caracteres deseados por los sucesivos
pasajes.
Cultivo celular

• Lento y gradual para evitar formación de
  cristales intracelulares
• Agregar agentes (DMSO) que se unen al agua ?
  formación de cristales y por consecuencia la
  concentración de electrolitos que aparecen que
  son perjudiciales para la célula

Congelación

• Lo más rápido posible

Descongelación
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Obtención de Anticuerpos Monoclonales
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Producción de Anticuerpos
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Producción de Anticuerpos
Sueros Policlonales - Baja proporción de Ac
específico (10) - Partidas de distinta
calidad. - Cantidad limitada.
Anticuerpo monoclonal - Alta proporción de Ac
específico - Partidas de calidad reproducible -
Cantidad ilimitada
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Objetivo Inmortalizar células productoras de
anticuerpos específicos mediante la fusión de dos
tipos celulares diferentes. Kohler y Milstein,
1975
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 - Células de Bazo del animal inmunizado (LB)
Capaces de secretar anticuerpos con especificidad
definida Vida media limitada in vitro
HGPRT - Células de Mieloma Capaces de
proliferar in vitro e in vivo No
secretoras de Ac. Deficientes en HGPRT
(Hipoxantil-Guanidil-Fosforibosil-Transferasa)  
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Requisitos
1) Animales requerimientos y esquemas de
inmunización 2) Células tumorales
Características Medios de cultivo y de
selección 3) Técnicas de fusión y selección de
híbridos 4) Clonación y conservación de las
clonas 5) Detección y caracterización de Acs.
Monoclonales 6) Producción in vitro e in vivo
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1) Animales
Especies Ratón y rata Cepas más empleadas
BALB/c (ratón), Y3 (rata) Buena respuesta ante
antígenos de distinta naturaleza Considerar las
condiciones higiénico sanitarias Esquemas de
inmunización Vías de inoculación, cantidad de
antígeno, acoplamiento a moléculas carrier, uso
de adyuvantes, tiempo entre inoculaciones. Conven
cional (3 o 4 inoculaciones c/adyuvante completo
/ incompleto) No convencional (ej planes de
hiperinmunización, inmunización
intraesplénica) Evaluación del título de
anticuerpos específicos en el suero de los
animales inmunizados Inoculación en solución
salina (booster), 3-4 días antes de la fusión.
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2) Células tumorales mielomas

• Características
• Adaptados a crecer in vitro con crecimento
  exponencial
• Marcador de selección deficiencia en el gen de
  la enzima Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil-Transfe
  rasa (HGPRT)
• No sintetizan ni secretan Igs propias
• Fenotipo para la alta secreción de Igs
• Capacidad para inducir tumores in vivo
• Libre de contaminantes (micoplasmas
  especialmente)
• Ejemplos P3/x63.Ag8.653, Sp2/0-Ag14, NS-1, NS-0

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2) Células tumorales mielomas
2) Células tumorales medios de selección
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2) Células tumorales medios de cultivo y
selección
Medios de cultivo (Medios semidefinidos) Compone
ntes básicos sales inorgánicas, sistemas buffer,
glucosa, aminoácidos (L-glutamina), piruvato,
vitaminas, indicadores de pH, etc. Ejemplos -
RPMI 1640 - Minimum Essential Medium (MEM) -
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), etc.
Suplementos - Suero fetal bovino (SFB) (
5-20) - Antibióticos - Antimicóticos -
Aminoácidos no esenciales
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2) Células tumorales medios de cultivo y
selección
Medios de selección Medios de cultivo adicionados
con HAT (Hipoxantina - Aminopterina -
Timidina) Aminopterina análogo del ácido
fólico Bloquea la sintesis de novo de pirimidinas
y purinas Hipoxantina Timidina requeridas
para la vía alternativa o de salvataje
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3) Técnicas de Fusión Celular
- Agente fusionante polietilenglicol (PEG),
SV40, etc. - Protocolos convencionales -
Variables - Proporción y número de células de
mieloma / células de bazo (/- 107 células de
mieloma, relación con células de bazo 11 a
14) - Tiempo de contacto con el agente
fusionante
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3) Técnicas de Fusión Celular

• Las células de mieloma (NS-1 o NS-0) son
  8-azaguanina resistentes y por lo tanto carecen
  de HGPRT
• La fusión de dos células de mieloma produce una
  célula incapaz de sobrevivir
• La fusión de dos esplenocitos produce una célula
  que muere dentro de las dos semanas en cultivo
• Sólo la fusión de una célula de mieloma con un
  esplenocito produce una célula capaz de
  sobrevivir en el medio de selección

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4) Técnicas de Clonado
Por dilución límite
2 células / well
1 célula / well
0.5 célula / well
En medios semisólidos
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5) Detección y Caracterización de Anticuerpos
Específicos

• Método de detección
• Sensibilidad (mg/ml)
• Especificidad
• Trabajar con poco volumen de muestra
• Rapidez y capacidad de análisis de un gran
  número de muestras de manera sencilla.
• Correspondencia con la utilidad final
• Metodologías empleadas ELISA, RIA, RBA, IFI

• Caracterización
• Isotipo ELISA, Inmunoprecipitación en gel
• Epitope reconocido ELISAs, immunoblot o Western
  blot
• Nativo o lineal, repetido, compartido con otras
  proteínas o reconocidos por otros monoclonales,
  etc
• Afinidad estimación por ELISA / RIA, de ser
  posible

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6) Producción in vitro e in vivo
La elección del tipo de producción depende del
uso y de las cantidades requeridas Producción in
vitro El uso no permite la producción in vivo
usos médicos El anticuerpo se obtiene libre de
proteínas y de virus de ratón pero con
componentes del medio de cultivo y proteínas del
SBF. Medios sintéticos sin agregado de sueros
facilitan la purificación
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6) Producción in vitro e in vivo
Producción in vitro En pequeña
escala Botellas o placas de cultivo El
anticuerpo se encuentra en el sobrenadante Concen
tración de Ac mg/ml En gran escala
Biorreactores homogéneos de burbujeo y
agitación constante Biorreactores heterogéneos
células crecen en microperlas o en cartuchos
(biorreactores de fibra hueca.) Concentración de
Ac mg/ml (grandes volúmenesde medio de cultivo)
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6) Producción in vitro e in vivo
Producción in vivo Líquido ascítico en ratones
compatibles con el tumor Ratones BALB/c,
inmunosuprimidos o atímicos - Inoculación
intraperitoneal de un aceite mineral
2,6,10,14-tetrametil pentadecano (Pristane) (0.5
ml/animal) - Inoculación IP de 1-2 x106
células/animal, 10-12 días después - Desarrollo
de tumor y líquido ascítico - Extracción por
punción IP - Concentración de Ac específico 1-10
mg/ml (5-10 ml de LA por ratón) contaminados con
otras proteínas murinas, y puede contener
patógenos
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(No Transcript)
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Resumen
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• Características
• Secreción de anticuerpos de especificidad,
  afinidad, isotipo, etc. definidos
• Secreción de Acs. en grandes cantidades (mg/ml in
  vitro, mg/ml in vivo)
• Crecimiento ilimitado in vitro (en medios
  relativamente simples)
• Clonación y congelación durante años
• Inducción de tumores ascíticos en animales
• Resultado
• Preparaciones específicas, repetibles e
  inagotables de anticuerpos

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Congelar