L'hybridation fluorescente (FISH)

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L'hybridation fluorescente (FISH)

• fluorescent in situ hybridization

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Définition

• repérer la présence d'anomalies chromosomiques
  par un système couplé anticorps-fluorophore
• Les sondes
• L'hybridation
• La révélation
• L'observation

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Les sondes
un brin d'ADN comportant des nucléotides
modifiés, à partir d'un brin matrice de départ.
polymériser le brin complémentaire entre des
hexamères de monobrin (brins composés de six
nucléotides aléatoires)
N brin complémentaire synthétise entre
l'hexamère 1 et l'hexamère 2 M brin matrice En
rose les nucléotides marqués
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trois types principaux de sondes

• séquences uniques identification dune séquence
  spécifique
• séquences multiples spécifiques à un chromosome
  entier.
• ADN ?-satellite identification de séquences au
  niveau du centromère du chromosome.

Les sondes marquées la biotine révélée par
l'avidine
la digoxygénine révélée par un anticorps
anti-digoxygénine, les deux couplés à un
fluorochrome
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Le principe
L'ADN cible parmi l'ADN cellulaire
Dénaturation de l'ADN cellulaire par chauffage
Une sonde d'ADN complémentaire de l'ADN cible et
munie d'une molécule de reconnaissance (R).
Hybridation de la sonde et de la séquence cible.
Révélation par reconnaissance de la molécule R
par un anticorps anti R muni d'un fluorophore
F. L'observation au microscope à fluorescence
permet de visualiser la présence de la séquence
cible.
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La révélation
système biotine-avidine reconnaître les sondes
par des anticorps flanqués de sites moléculaires
fluorescent,
biotine liée de streptavidine possédant un site
fluorescent.elles-mêmes reconnues par des
anticorps anti-avidine "équipés" d'un site
biotine et d'un site fluorescent (ou
fluorophore).
M brin d' ADN matrice dénaturé , H séquence
sonde hybridée.
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L'observation
microscope à fluorescence, la lumière émise par
les sites fluorescent sites hybridés.
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INDICATIONS
Diagnostic de la trisomie 21
Individu A
Individu B
Une sonde pour identifier le chromosome 13
(vert), une sonde pour identifier le chromosome
21 (rouge)
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TECHNIQUE RAPIDE DE DIAGNOSTIC PRENATAL

• Lamniocentèse dépister les anomalies
  chromosomiques
• Lanalyse FISH pas de culture cellulaire. Elle
  sapplique directement aux cellules contenues
  dans le liquide amniotique.
• fréquence anomalies chromosomiques Les trisomies
  des chromosomes 21,13, 18, X et Y représentent
  70 des anomalies.
• Ce test dépiste la trisomie 21, la trisomie 13 et
  la trisomie 18 ainsi que les anomalies de nombre
  des chromosomes sexuels (Turner, triple X,
  Klinefelter, Double Y).

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DIAGNOSTIC PRENATAL

• Lanalyse fiabilité 99,9
• Le taux de réussite technique 97 anomalies
  numériques des chromosomes 21, 18, 13, X, Y.
• 3 causes principales des échecs  
• le nombre de noyaux est trop faible
• les noyaux sont dorigine maternelle
• un problème technique lors de la manipulation.

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Diagnostic d'une translocation équilibrée.
un chromosome ou un fragment de chromosome se
soude à un autre chromosome. translocation
équilibrée phénotype de l'individu est normal
il n'y a alors ni perte , ni gain de matériel
génétique
ex translocation équilibrée entre les
chromosomes 11 et 12
Une sonde du chromosome 11 (rose) une sonde
caractéristique du chromosome 12 (vert)
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Diagnostic d'une délétion
Une délétion perte d'un fragment de chromosome.
ex sd de Di George anomalies thymiques,
cardiaques ,hormonaux et psychiques
individu normal
individu malade
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Les deux caryotypes après la technique du FISH
Individu normal individu
malade
Marquage de l'extrémité du chromosome 22 sonde
associée à un marqueur vert marquage de la zone
absente après délétion, avec une sonde associée à
un marqueur rouge
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Étude de cellules malignes
marquage avec un mélange de plusieurs sondes
chacune associée à un fluorophore différent
permet une "peinture des chromosomes".Exemple
étude chromosomique d'une cellule cancéreuse du
foie chez l'homme.  
a après révélation b après traitement à
l'ordinateur  
cellules malignes nombreuses anomalies
chromosomiques
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Limites du test

• Le FISH 70 des anomalies en moins de 48
  heures.

• Ce test ne dépiste que les anomalies des
  chromosomes
• ne dépiste pas les anomalies des gènes des
  chromosomes.
• recourir à un conseil génétique qui permettra
  denvisager le diagnostic prénatal souhaitable
  lors de maladie génétique due à une mutation
  génique.

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Caryotype
Le caryotype(ou caryogramme) arrangement
standard de l'ensemble des chromosomes d'une
cellule. Les chromosomes sont photographiés et
disposés selon un format standard  par paire et
classés par taille. but détecter des
aberrations chromosomiques (comme la trisomie 21)
ou d'identifier certains aspects du génome de
l'individu, comme le sexe (XX ou XY).
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Caryotype d'un individu de sexe masculin (XY)