Obtention de la squence nuclotidique codante pour la GFP

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Obtention de la séquence nucléotidique codante
pour la GFP

• I- Reverse transcription de lARN en ADNc par
  RT-PCR
• II- Amplification de lADNc codant pour la
  protéine fluorescente par PCR
• III- Vérification de lamplification de lADNc
  par électrophorèse
• IV- Purification de lADNc pour létape suivante

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I- Reverse transcription de lARN en ADNc par
RT-PCR

• On utilise la RT-PCR pour obtenir lADNc totale
  de lorganisme fluorescent.
• RT-PCR reverse transcription de lARNm en ADNc,
  cest-à-dire que la RT- PCR retranscrit luracile
  de lARN en thymine de façon à donner un brin
  dADNc.
• Comment passe-t-on de lARN à lADNc ?
• Schéma

s
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II. Amplification de lADNc codant pour la
protéine fluorescente par PCR

• Schéma un cycle de PCR

(spécifiques)
X 26 cycles
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III- Vérification de lamplification de lADNc
par électrophorèse

• Lélectrophorèse permet la migration de lADNc du
  négatif vers le positif (car celui-ci est
  négatif). Plus la taille est petite, plus la
  molécule migre vers le pôle positif.

Echelle C3 T1 C4
C1 C2
En paires de bases 2 000
1 500 1 000 500

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• On mesure la distance entre le puits et les
  résidus fluorescents

Léchelle est
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• Daprès cette échelle on peut tracer la courbe
  représentative suivante

Grâce à cette courbe nous pouvons dire que
pour _ C3, le résidu fluorescent dans le gel
correspond aux oligonucléotides. _ T1, le
résidu fluorescent dans le gel correspond à 750
paires de bases d'ADNc. _ C4, le résidu
fluorescent dans le gel correspond à 750 paires
de bases d'ADNc.
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IV- Purification de lADNc pour létape suivante
Prélèvement au scalpel

• La purification sert à enlever lexcès de
  tampon, de dNTP, denzymes et damorces et donc à
  obtenir un ADNc pur.

On obtient un ADNc pur qui servira pour létape
suivante.
1000 pb
500 pb
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  du NCIS
• _ Florent
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• _ Elodie
• _ Alice
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