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Université Claude Bernard Lyon 1UMR CNRS
5557USC INRA 1193
Méthylation et métalloïdes toxiques B. Cournoyer
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Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques

• plusieurs bactéries pathogènes résistantes au
  tellurite
• et/ou sélénite
• - P. syringae, Agrobacterium tumefa ciens
• - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella
  typhimurium
• - Staphylococcus aureus

Odeur dail
réduction
K2TeO3 4ppm 
Pourquoi? Quel mécanisme? Méthylation?
3
Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques

• Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996)
• P. syringae

Odeur dail DMTe
HincII
HincII
EcoRI
EcoRI
EcoRI
XhoI
SmaI
PstI
1.65
0.92
T3
LB
T7
1
2
0
E. coli tpmE sélénite
K2TeO3 4ppm 
E. coli TPMT-E
Analyse GC-MS
(Ranjard et al., 2000)
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Caractérisation de la bTPMT

• Caractéristique du déterminant
• - forte homologie avec la thiopurine méthyle
  transférase (TPMT) humaine (30 identités 55
  similarités)
• Gmelin (1824) odorous materials obtained from
  Se et Te during animal experiments a garlic-like
  odour (première observation)
• - Idem chez lHomme lors dintoxication au Se et
  Te

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Métabolisme des thiopurines

• Fin des années 80, la TPMT est montrée
  essentielle pour le métabolisme des pro-drogues
  6-mercaptopurine et
• thioguanine nucleotides

Krynetski Evans, Oncogene, 2003
HPTR hypoxanthine phosphoribosyltransferase
Autres fonctions chez lHomme - détoxication de
métalloïdes???
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Suite des travaux sur les bTPMT
Introduction de toxiques (As, Se, Te, etc) dans
lenvironnement
Produits volatils observés e. g. DMSe,
DMDSe, DMSSe, etc
GC-MS
Sol (10 g)
Présence de bTPMT ??
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Détection des gènes de la bTPMT

• Stratégie mise en place
• - élaboration dun crible PCR / utilisation des
  domaines conservés
• TPMT-E vs huTPMT (30 identités 55 similarités)

TPMT-E
43
127
1
216 AA
78 AA 234 bp
détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des
sols et des eaux
8

A
B
Diversité des bTPMT
C
D

E
F
G
(eubacteria)

H

UbiG
I
J
uniquement chez 30 des g-proteobacteria

K

L
M
bTPMT
N

O

• - plus de 50 de
• similarités
• plusieurs allèles
• par lignée

P
Q
R
S
T
U

• sol (7)

V
b, Bordetella spp.
X

Homme, Rat, Souris
TPMT
UNK
(b et g-proteobacteria)
Publication Favre-Bonté et al., 2005 ms en
cours de rédaction
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Affinité des bTPMT pour les métalloïdes
Avant induction
Après induction
Extrait soluble
TPMT G1
TPMT G3
TPMT G2
Marqueurs
TPMT-E
TPMT-G
Coupure de lHis tag
Chromatographie d'affinité TPMT-G Ni-NTA
(élution par 250 mM imidazole) TPMT-E
Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM
glutathion)
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Affinité des bTPMT pour les métalloïdes

• Mise au point des tests enzymatiques
• . tampon de réaction (selon Krynetski et al.,
  1995)
• . choix du substrat 6-mercaptopurine

TPMT
. Immuno-suppresseur (lors des greffes) .
Traitement de la leucémie, et . Maladie
auto-immune
DO 320
10 µM TPMT-E
Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP
par TPMT-E et les 3-TPMT-G.
huTPMT, Km 10.6 mM
Activité de méthylation de la 6-MP
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Affinité des formes enzymatiques pour les
toxiques séléniés

• méthylation de substrats séléniés
  6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite et
• séléniate
• . avec des extraits de protéines totales TPMT
• - obtention de DMSe à partir de Se-cystine
• - absence dactivités avec le sélénite
• . en cours, comparaison des affinités et vitesse
  de réaction entre
• mercaptopurine et séléno-purine

DO 350
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Substrats de la méthyle transférase bTPMT
CH3SeCH3
S, Se, Te inorg. et org.
Autres produits DMS, DMDS, DMDSe DMSeS, DMTe
SAM
SAH
bTPMT
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bTPMT et lAs? La piste des odeurs

• Bartolomeo Gosio (1892) obtained a garlic like
  odor from microbes growing on a potato mash
  containing arsenic trioxide
• Scopulariopsis brevicaulis (Gosios fungi)
• Gosios garlic-like gas (TMA) from As
• mercaptan-like odour (DMSe) from selenite
• garlic-like odour (DMTe) from tellurite

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Méthylation bactérienne de lAs (en aérobiose)

• Etat des lieux
• E. coli DMA TMAO (trimethylarsine oxide)
• - Nocardia MMA (CH3)nAsH3-n (les méthyle
  arsines)
• Bactéries TPMT
• Pseudomonas sp. arséniate (CH3)2AsH
• Aeromonas et Alcaligenes méthyle arsoniate
  (MMA) (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH

As dans lenvironnement
Produits volatils observés - MeAs, DMeAs, TMeAs
There are apparently no accounts of the
characterization of specific arsenic
methyltransferases from microorganisms (Bentley
and Chasteen, 2002)
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Autres As métalloïdes-méthyle transférases ?

• Les pistes
• 1. Les proches voisins de la TPMT
• - UbiG (demethylubiquinone methyltransferase)
• UNK (putative methyltransferases)
• 2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle
  transférases)
• - Découverte simultanée nouvelle famille de
  Se/Te-méthyltransférases

UbiE
MMT
Se-méthylation

• large distribution
• plusieurs duplications
• synthèse de métabolites
• secondaires dont
• certains antibiotiques et
• certaines molécules
• anti-cancéreuses
• présence dans les eaux

• Ensemble
• des eubacteries

pas Se-méthylation
Ranjard et al., 2004
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Conclusions

• Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle
  de la TPMT
• dans la méthylation de lAs
• Les formes méthylées de lAs sont obtenues dans
  les conditions
• dexpression de la TPMT ou chez des organismes
  TPMT
• 3. Dautres méthyle transférases pourraient
  jouer un rôle
• UbiG, certaines methyle transférases putatives,
  et MMT

• Même famille - plusieurs lignées (23)
• chez les g-protéobactéries
• structures différentes
• substrats différents?

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Perspectives

• Voies de méthylation de lAs
• - Recrutement dun étudiant M2
• e. g.
• . les formes de bTPMT et la méthylation de
  substrats arséniés
• . Analyse comparative des affinités pour les
  substrats S , Se ,
• Te et As
• Recherche partenaire au sein du GDR-As
  (co-encadrement du M2)
• pour le volet chimie analytique
  (détection/caractérisation des
• formes méthylées)

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Bactéries Pathogènes Opportunistes et
Environnement
Participants L. Champier S. Favre-Bonté L.
Ranjard C. Prigent-Combaret qqes stagiaires C.
Monnez E. Brothier S. Favre-Bonté S. Nazaret B.
Cournoyer

• Remerciements
• ToxNuc-Environnement
• CNRS UCBL - ENVL
• Région Rhône-Alpes

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(?)
(?)
Méthylation de lA s
MeAs
DMeAs
Excrété dans les urines

0


Methyl- arsonate
Trimethyl- arsine oxide (TMAO)
Dimethyl- arsinate
arsenate
AsH3,

• Inorganic forms of arsenic are more toxic than
  organic forms
• - Trivalent forms are more toxic than pentavalent

arsenite
Methyl- arsonite
Dimethyl- arsinite
Trimethyl- Arsine (TMA)


0 (selon Cullen et Bentley, 2005)
0
(According to Challenger (1951))
AsH3 gaz, As(-III) gt As(III) gt As (V) gt composés
méthylés