CANCER GENE THERAPY

1
A QUEST CE QUE LE TRANSFERT DE GENES ?
2
QUE PEUT ON ATTENDRE DU TRANSFERT DE GENES ?

• Traitement des maladies génétiques
• Maladies héréditaires (mucoviscidose, enfants
  SCID, myopathies, ADA, Maladie de huntington )
  (75 protocoles)
• Maladies acquises (cancers ) (378 protocoles
  cliniques)
• Maladies cardiovasculaires
• Atherosclérose, restenose
• Vaccination
• HIV (38 protocoles cliniques), Hepatite C, Grippe
  .
• Thérapie cellulaire
• Amélioration des cellules souches
• Autres ..
• 170 entreprises parient sur la thérapie génique
  aux USA

3
QUELQUES DATES SUR LA THERAPIE GENIQUE

• 1989 marquage des TIL par neo
• (Rosenberg, N Eng J Med 1990)
• 1990 2 enfants atteints dune déficience en
  adenosine desaminase guéris par thérapie génique
  (Blaese, Science 1995)
• 1998 351 protocoles - 2687 patients
• 2000 premier succès français avec la guérison
  denfants bulles (Fisher, Nature, 2000)
• 2001 600 protocoles - 3494 patients

4
I. PRESENTATION DU TRANSFERT DE GENES

• A Que peut on appeler TRANSFERT DE GENES
• A1 Transplantation dorgane Amener un ensemble
  de cellules saines à un organisme déficient en
  ces cellules
• - transplantation de moelle osseuse
• - transplantation du foie, des reins, du cur,
  des poumons
• - 30.000 patients opérés en France depuis le
  début
• thérapie génique ex vivo avec cellules
  autologues ou allogéniques

5
A3 Transfert de gènes
a) Modification dun gène cellulaire
(recombinaison homologue) A1 méthodologies de
base
Cellules
/- cassette de sélection
Gène sain
Séquences flaquantes connues
Gène muté
Microinjection à une cellule Ex oocyte fécondé !
6
- Souris transgénique qui expriment
ou surexpriment un gène dintérêt - Souris
transgéniques qui nexpriment Plus un gène
dintérêt (souris KO)
Modèle applicable à de nombreuses espèces dont
lhomme. Rigoureusement interdit dans de
nombreux pays dont la France Difficulté à
appliquer à un grand nombre de cellules
7
b) Addition dun nouveau gène
8
B THERAPIE GENIQUE GERMINALE ET
SOMATIQUE THERAPIE GENIQUE GERMINALE -
recombinaison homologue entre deux gènes gène
sain qui remplace gène pathologique invalidation
dun gène gt microinjection dADN dans un
embryon au stade 4 THERAPIE GENIQUE SOMATIQUE
- modification génique dun groupe de
cellules voire dun organe entier
9
C LES DIFFERENTES APPROCHES .

• EX VIVO
• Modification des cellules dans un laboratoire
  approprié - certification des cellules
• g irradiation potentielle
• IN VIVO
• administration directe des vecteurs de
  transfert de gènes
• problème du ciblage des cellules à modifier

10
PRINCIPE DE LA THÉRAPIE GENIQUE EX VIVO
Cellules hétérologues

injection
Biopsie De cellules
Autologues
Culture cellulaire
Control de Lexpression du ou des transgènes
Mise en contact avec le vecteur
Modification génique



Selection des Cellules génétiquement modifiées
11
THERAPIE GENIQUE EX VIVO CELLULES CIBLES

• Cellules Autologues
• - cellules tumorales
• - Fibroblastes
• - cellules du système Immunitaire (DC, TIL, LT
  ......)
• - cellules du système hematopoietique
• Cellules Allogeniques
• cellules xenogéniques (ex. CellulesVero)

12
PRINCIPE DE LA THERAPIE GENIQUE IN VIVO


Construction dun vecteur qui code pour le gène
thérapeutique
Injection



Contrôle du vecteur viral (absence de de RCR par
exemple)
13
B Premier partenaire la cassette dexpression
le gène
14
a) Cas de laddition dune fonction
Gène cassette dexpression

• GENE
• ADNc ou génomique (avantages et inconvénients)
• PROMOTEUR
• Constitutif (ex. CMV, SV40, etc.)
• Tissu spécifique
• Inductible (Dexamethasone, tetracycline, metaux,
  .)
• Repressible (tetracycline)

15
. SEQUENCE DE POLYADENYLATION . UN OU PLUSIEURS
GENES (DEUX PROMOTEURS, IRES ..) .
16
b) Cas de linhibition de gènes

• siRNA, ribozyme, antisens
• Cas des antisens
• But inhiber la traduction dun ARNm en
  lhybridant avec un ARNm complémentaire et
  antiparallèle

5 ACGTAATGGGGAGTCCAGGTGTC 3
3 TGCATTACCCCTCAGGTCCACAG 5
5 ACGUAAUGGGGAGUCCAGGUGUC 3
5 GACACCUGGACUCCCCAUUACGU 3
17
RNA INTERFERENCE

• Suppression of mammalian gene expression
• Duplexes of 19-23 nucleotides RNAs
• RNA polymerase III driven expression of siRNAs
• H1 or U6 RNA gene promoters
• Transcriptional termination occurs at 4
  consecutive T residues in the DNA template

Adapted from Hannon G.J. (2002) Nature 418
244-251
18
Day 3
Day 7
Day 9
Non-infected
LacZ
siGFP
Overexposed
Lentivirus NI LacZ
NI siGFP
Day 9
9
3
9
9
7
7
3
GFP
Western blot
?-tubulin
19
b) Cas de linhibition de gènes

• siRNA, ribozyme, antisens
• Cas des siRNA
• Découvert par Fire et Melo par hazard (double
  brin dADN
• incorpore dans un complexe silenceur RISC
• Séquence dADN choisie par analyse du génome
• PROMOTEUR
• H1ou H6 (polymerase III)

U6 promoteur
19-21 nt coding sequence
19-21 nt coding sequence
6 nt spacer
20
. PREREQUIS Conséquences de lexpression du
transgène réponse immune ? Toxicité ? Bilan
sanguin des patients, Evaluation clinique des
patients Devenir du matériel génétique vitesse
de dégradation de lADN Recherche du transgène
par PCR sur biopsie Conséquences de
lintégration du gène Analyse par Southern blot
(si possible ..) Expression génique ARNm
(stabilité et quantité) Analyse par RT-PCR sur
biopie Protéine (stabilité et
quantité) Western, Elisa, Cytometrie en flux
Compartimentation de la protéine
21
C DEUXIEME PARTENAIRE LE VECTEUR
22
PREREQUIS POUR LE VECTEUR IDEAL

• Large capacité dinsertion
• Non toxique
• Non immunogène
• Disponible sous forme concentré
• Parfaitement défini et contrôlable
• Permettant une expression à long terme (ou
  transitoire)
• Aisément produit
• Ciblage
• Pas de replication de lADN viral (cas des
  vecteurs viraux)

23
C.1 ADN (ARN) nu METHODE  NATURELLE 
Injection intra-musculaire

24
C.2 METHODES PHYSIQUES
Avantages Limites Electroporation
Complètement synthétique Faible
efficacité
Canon à particules Faible
efficacité (gene gun)
25
nonviral vectors
1st generation cationic lipids
?
1/106
2nd cationic polymers
yet 1 microgram DNA contains 1011 molecules
26
C. 3 METHODES CHIMIQUES
Vecteur Avantages Limites CaPO4
Complètement synthétique Pas de ciblage
possible faible
efficacité non toxique Lipides
Complètement synthétique Pas de ciblage
possible faible
efficacité non toxique Complexes
dADN ciblage possible faible
efficacité non toxique
27
C. 4 VECTEURS VIRAUX

• Vecteur / taille Avantages Limites
• Retrovirus / 10 kb Intégration dans
  génome efficacité de transfection
  moyenneInsertion. 9-12 kb necessite une
  division cellulaire Replication competence ?
• une copie/génome
• Lentivirus Intégration dans génome
• infecte cellules quiescentes ou en division
• plusieurs copies par génome
• Adenovirus / 35 kb Grande efficacité
  Epigenomique
• Insertion. 5 kb infecte tout Replication
  competence ?
• Toxicité/Immunogénicité
• Adeno-Ass Virus longt terme bonne efficacité
• Insertion. 5 kb non toxique
• faible titre
• Herpes simplex tropisme neuronal Toxicité
  insertion. 40-50 kb

28
HSV
Adenovirus
AAV
Lentivirus
Titers
gt1010
gt1011
gt108
gt1012
Cloning capacity Helper-dependent
10-30 kb
8-10 kb 30 kb
8-9 kb
3.5-4 kb
Integration
no
no
yes
yes/no
Target cells(/- dividing)
/ -
/ -
/ -
/ -
Expression Helper-dependent
Short
Short Long
Long
Long
Pre-existing Host immunity
unlikely
yes
yes
n.d.
Retrograde transport
yes
yes
yes
no
Brain Tropism
neurons
neurons
AAV5gt4gt2
neurons/glia
29
RETROVIRUS VECTEURSa.1 Présentation des
rétrovirus

• Les retrovirus comportent
• Les oncoviridie (MuLV, HTLV1, HTLV2, .)
• Les lentiviridae (HIV1, HIV2, SIV, BIV, ..)
• Les spumaviridae
• Oncoviridae
• MuLV Virus de la leucemie murine
• Virus enveloppé, 30 nm de diamètre
• Virus à ARN, simple brin (2 coipes par particule
  virale)
• Son cycle cellulaire comprend son intégration
  dans le gènome de la cellule infectée
• Présentation du génome du retrovirus de Moloney
  (MuLV)

RT Rnase H Integrase
Protéines de la capside
30
a. 2) Cycle viral
R U5
U3 R
Fixation au récepteur et adsorption
Reverse transcription
Endocytose
Circularisation
Transport au noyau
Intégration
Assemblage de la capside
Transcription
Assemblage du virus
(A)n
(A)n
31
a. 3) Retrovirus vecteurs

• Très bien connus et utilisés depuis 1981 pour le
  transfert de gènes
• Toutes les séquences codantes peuvent être
  amenées en trans
• Elaboration de lignées cellulaires dempaquetage
  (Packaging cell lines)
• Exemple de construction plasmidiques nécessaires
  à lélaboration dune lignée dempaquetage

• Co-transfection dans une lignée de cellules
  murines immortelles
• Lignée dempaquetage
• ecotrope ou amphotrope

32
a. 4) Obtention dun retrovirus vecteur
Gène thérapeutique
LTR
Psi
LTR
AmpR
Ori
2
Particules Pseudo-virales vides
Collecte sur 72 heures
33
a. 5) tests réalisés sur les lots de retrovirus
vecteurs, sur les cellules modifiées
génétiquement ex vivo ou sur les fluides
biologiques des patients
Tests de stérilité deux premiers cas
uniquement Tests de labsence de RCR
(replicative competent retrovirus) dosage de
la reverse transcriptasedu vecteur bGal Test de
mobilisation de bGal Mise en presence du
materiels a tester avec cellules mus dunni
(cellule de la veine de la queue de souris
transfectées par LTR-psi-Bgal-polyA Si gag
pol env presents alors mobilisation On teste
le surnageant de cellules mus dunni mises en
contact du surnageant à tester gt coloration X
gal gt si cellules bleues alors RCR présents.
LTR
psi
bgal
polyA
34
a. 6) conclusion

• Facile à produire et à manipuler
• Instable et de faible titre (106)
• Très infectieux , large spectre dhôte
• Cellules en division
• Intégration du génome viral gt expression stable
  mais génotoxicité potentielle
• Facile à administrer
• Non toxique
• Non immunogène
• RCR ?

35
a. 7) Lentivirus vecteurs
1983 découverte de HIV-1 (Gallo-Montagné) Virus
à ARN positif se multipliant dans les cellules
CD4 ou macrophages Même organisation que
oncovirus mais 9 cadres de lecture ouverts
Infectent les cellules en division et les
cellules quiescentes (hépatocytes, neurones,
myocytes, Intégration du génôme viral dans tous
les cas.
36
LTR
Psi-gag
RR?
LTR
CMV
Gene thérapeutique
293T

• Conclusion
• Facile à produire et à manipuler
• stable et de bon titre (109)
• Très infectieux , large spectre dhôte
• Cellules en division et quiescentes
• Intégration du génome viral gt expression stable
  mais génotoxicité potentielle (5 copies/cellule)
• Facile à administrer
• Non toxique
• Non immunogène
• RCR ?

37
b) ADENOVIRUS VECTEURS

• b. 1 Presentation
• - Virus non enveloppé icosaédrique
• - 60-90 nm - 240 hexons et 12 pentons 1,34g/ml en
  CsCl
• - 47 serotypes divisés en 6 groupes (A à F) Les
  plus connus groupe C sérotype 1, 2, 5 et 6
• Virus à ADN DB linéaire
• b. 2 Cycle viral
• Fixation à un récepteur via une fiber protéine
• Internalisation grâce à des vésicules enveloppées
  de clathrin
• Libération du virus des endosomes. Decapsidation
  et transport de lADN viral
• Vers le noyau
• Transcription dès la deuxième heure post
  infection (phase précose 6 à 9 heures post
  infection)
• Puis replication ADN viral phase tardive
• 10.000 virion/cellule infectée 1 cycle 32 à
  36 heures

38
b. 3 adenovirus vecteurs
Quelles séquences doit on déleter du génome de
ladénovirus pour quil ne se réplique pas
? Gènome de ladénovirus Région E1 (E1A et
E1B) sa transcription conditionne la
transcription de tout le reste. E1A activatrice
de transcription, E1B potentialité anti
nucléase, stabilité des ARNm . E2 Réplication
de lADN viral E3 E4 Réplication, inhibition
de la transcription des gènes cellulaires,
transcription des gènes tardifs. Virus délété de
E1 1ere génération E1 E3 3ème
génération E1, E2, E3 4ème génération Gutles
s On les obtient dans des cellules
transcomplémentantes qui expriment les protéines
(E1 .) manquantes.
39
b.4) SYNTHÉSE DUN ADENOVIRUS VECTEUR
S.I
1) Clonage de la séquence dintérêt dans le
vecteur Shuttle (Qbiogen)
KanaR
2) Recombinaison avec la 2ème partie du virus
dans BJ5183 3) Sélection des clones
recombinants Vérification de leur conformité
40
1-2 semaines
5) Attente de leffet cytopathique
6) Extraction des particules virales des
cellules lysées - test des particules
(western, Elisa, FACS...) - extraction de lADN
viral (Minihirt) séquençage 7) Synthèse du lot
viral 2 x 1012 pv
41
b. 5) conclusion

• Facile à produire et à manipuler
• Instable et de très haut titre (1011)
• Très infectieux , large spectre dhôte
• Cellules en division ou quiescentes
• Pas dIntégration du génome viral gt expression
  transsitoire gt pas de genotoxicité
• Facile à administrer
• Non toxique
• Immunogène
• RCA
• Cas des virus ONYX Delta E1

42
Utilisation des différents vecteurs au cours
dessais cliniques 2002
43
D QUATRIÈME PARTENAIRE LES CELLULES CIBLES
44
Protocole de thérapie génique en 2002
45

• D. 1) MARQUAGE Vérification de la présence sur
  les cellules cibles des récepteurs au vecteur
  viral sélectionné
• vecteurs GFP, ?gal ou luciférase

Comparaison des vecteurs viraux pour la
modification génique des cellules de mélanome in
vivo
46
Adenovirus vecteurs - Administration systemique
100
10
1
0.1
Courtesy of J. Johnson, Bristol

• Lipid metabolism
• Factory for secreted genes

0.01
Heart
Lung
Liver
Stomach
Spleen
Kidney
Brain
Organ
47
D. 2 Traitements de maladies monogéniques

• Maladies du systême hématopoïétiques
• Immunodéficience enfants SCID X
• Déficience en adénosine désaminase
• Traitements de la maladie neurodégénérative
• Maladie de hungtinton
• Traitement de maladies cardiovasculaires
• Hémophilie
• Myopathie de Duchesne
• Mucoviscidose
• Traitement de lépidermolyse bulleuse recessive
  dystrophique
• Pathologies oculaires

48
Applications potentielles de la thérapie génique
aux maladies du systeme hematopoïétique

• Immunodeficiencies congénitales
• ADA-deficient SCID,
• X-linked SCID,
• JAK-3 deficient SCID, PNP-deficient SCID,
  perforin deficiency, X-linked agammaglobulinemia,
  Leukocyte Adhesion Deficiency
• Maladies granulomateuses chroniques
• Thalassemies
• Hemoglobinopathies
• Anemie de Fanconis
• Defaut de conservations Lysosomiales
• Maladies de Krabbe etc

• Oncologie
• Transfert de gènes de multirésistance aux drogues
  (i.e. MDR, MGMT)
• Protection from stem cell toxicity of
  chemotherapy
• Purge des cellules souches dans les greffes
• Mort selective des cellules tumorales
• Transfert de gènes suppresseurs de tumeur
  /antisense/siRNA
• Immunotherapie des cancers

49
Transfert de Gènes dans les cellules souches
hematopoïétiques
retroviral vectors (oncoretroviral or lentiviral)
in vivo
adenoviral vectors AAV vectors lentiviral vectors
ex vivo
50
Expériences pré-cliniques à réaliser sur des
cellules souches hématopoïétiques

• Essais in vitro (flow cytometry, CFU-C, LTC-IC,
  B/NK assays)
• Essais In vivo (petits animaux)
• NOD/SCID mouse/human chimeras
• SCID-hu mouse/human chimeras
• Essais In vivo (grands animaux)
• chiens
• Primates

51
Protocole clinique de Marina Cavazana - Alain
Fisher Traitement des enfants présentant un
déficit SCID X-1 gC (immunodéficience combinée
sévère)Maladie héréditaire, liée à lX,
mutation du gène codant la sous unité g du
recepteuraux cytokines 2, 4, 7, 9, et 15
?C chain (IL2, IL4, IL7, IL15, IL21 recepteur)
Blood
Thymus
T cell

• Bloquage précose de la différentiation des
  lymphocytes T et NK
• absence des fonctions des T-, NK- B

NK cell
erythrocyte
B cell
granulocyte
platelet
macrophage
monocyte
Bone marrow
dendritic cell
Tissues
52
Traitements possibles

• - transplantation de moelle osseuse
• si donneur HLA compatible 90 survie mais
  cela concerne 30 des enfants
• si pas de donneur compatible (père ou mère)
  30 de survie médiane
• avec séquelles importantes
• Thérapie génique

53
Protocole
?c-chain retroviral vector
Blood
Thymus
T cell
NK cell
B cell
erythrocyte
platelet
granulocyte
monocyte
Bone marrow
macrophage
CD34 bone marrow cells
dendritic cell
Tissues
54
Etudes précliniques
Lexpression de la sous unité gC du récepteur et
la différenciation des LT et des NK A été obtenu
après transfert de gènes chez la souris gC
-. Lexpression à long terme de la sous unité gC
du récepteur a été obtenu après Transfert de
gènes dans les cellules CD34 canines. Pertinence
de la stratégie Avantages sélectifs des cellules
génétiquement modifiées après interaction de la
sous unité gC du récepteur avec IL-7 et
IL-15, Signaux prolifératifs et de survie aux NK
et aux LT.
55
Protocole clinique
CD34 isolés de la moelle osseuse 3 infections
successives in vitro par RV codant la sous unité
g du récepteur Injections (environ 19 106
cellules réinjectées) Evaluation de lexpression
du transgène PCR, RT-PCR transgène détecté
sur tous les patients Immunofluorescence sur LT
prélevés de patients Prolifération des LT en
présence de PHA ou anti CD3 Vaccination des
enfants contre le tétanos, la poliomyelite, le
BCG évolution de la prolifération des
LT Détection des anticorps anti-tétanos, polio
etc . IgG, IgM Sortie des enfants du
confinement stérile à J 100 environ Retour à la
maison et scolarisation
56
(No Transcript)
57
Conclusion 11 patients traités de moins de 1
an 100 des LT et des NK ont le transgène 1
copie/cellule 1 des LB et des monocytes ont le
transgène 0,1 des polynucléaires 10/11 sont
guéris de leur pathologie
Hacein-Bey-Abina S. et al., NEJM 346 1185
(2002) Science 302 415 (2003)
58
Cas du patient numéro 4

• Ce patient a développé une leucémie 3 ans après
  le traitement
• M30 comptage des LT normal (7000/ul) Varicelle
• M 31 à 34 50.000 à80.000 LT/ul pas de
  symptome
• M 34 300.000 LT/ul splenomegaly
• M35 chimiothérapie -gt 500LT/ul
• Les LT sont normaux, une seule intégration du
  transgène sur le chromosome 11 p1-3 gène LMO-2
  gt Expression abérante de LMO-2
• Pas de transcription anormale à partir du LTR
• Pas de RCR
• Translocation 6-13
• Hypothèses
• Mutation insertionnelle
• Varicelle
• Prédisposition génétique
• Arrêt de lessai clinique
• Effet du transgène, effet du vecteur, effet du
  receveur, proliferation des cellules cibles

59
Hacein-Bey-Abina S. et al., NEJM 348 255 (2003)