Pr

1
PREPARATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE
I RECUEIL DU SPECIMEN 1 - Nature du
spécimen 2 - Mode de recueil 3
Conservation II - EXTRACTION DES ACIDES
NUCLEIQUES 1 - Préparation de lADN 2
Préparation de lARN
2
Acides nucléiques polynucléotides

• Polymère
• répétition n fois du motif monomère
  mononucléotide lié par des liaisons
  phosphodiester 3-5

3
ADN - ARN

• 3 types
• ARN ribosomal associé à des protéines (ARNr)
• ARN messager (ARNm)
• ARN de transfert (ARNt)

• 2 types
• procaryotes
• 1 double brin
• eucaryotes
• plusieurs doubles brins associés à des protéines

4
ADN Organisation de la double chaîne

• Orientation en sens opposés
• des deux brins
• à antiparallèles

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Double hélice illustrations
6
I - Extraction dADN
Echantillon
7
PREPARATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE
I Préparation de lADN
II Préparation de lARN
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Classification des ARN

• 3 groupes importants
• ARN ribosomal associé à des protéines pour
  former les ribosomes
• ARN messager vecteur de linformation génétique
  entre ADN et les protéines
• ARN de transfert transport des acides aminés
  sous forme dester au cours de la synthèse des
  protéines
• autres ARN
• sn ARN

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II -EXTRACTION DE LARN

• ARN plus instable que lADN à cause des RNAses
• Cellules ou tissus traités immédiatement
• - congélation
• - détergent SDS
• - agent dissociant isothiocyanate de guanidine
• - solution tampon
• - agent réducteur ? mercapto- éthanol
• inhibition des RNAses, dénaturation des
  protéines
• Séparation ARN / ADN
• par précipitation différentielle en fonction du
  pH
• - Séparation des ARN messagers basée sur la
  présence des
• polyA présents à lextrémité 3

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LES OUTILS ENZYMATIQUES
I Hydrolyse des Acides Nucléiques
II Visualisation des fragments de restriction
III Utilisation des enzymes de restriction -
carte de restriction
I V Les autres enzymes
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Hydrolyse des acides nucléiques

• Rappel
• enchaînement des monomères par des liaisons
  phosphodiesters
• Chimique
• Enzymatique

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A - NUCLEASES

• hydrolases de type estérase Nucléases
• agissent in vivo et in vitro
• 2 types selon substrat
• DNases désoxyribonucléases
• RNases ribonucléases

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Nucléases
? Exonucléases libèrent par hydrolyse le
nucléotide situé à lextrémité 5 ou 3
? Endonucléases hydrolysent une liaison ester
interne.
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Nucléases

• Spécificité
• Large
• ?Nuclease S1
• ?DNAses DNAse I
• ?RNAses RNAse A, H
• Etroite 1 séquence particulière
• endonucléases de restriction

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B - Enzymes de restriction
? Origine système de protection des bactéries
? Nomenclature
Escherichia coli R y13
EcoR I 1ère enzyme trouvée chez E. coli
EcoR V 5ème enzyme trouvée chez E. coli
Providencia Stuarti Pst I
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? LES SEQUENCES RECONNUES palindromiques
COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex EcoR I
5G A A T T C .3 5. G
AATTC3 3C T T A A G.5 3..
CTTAA G5
17
(No Transcript)
18
? EXEMPLE COUPURE PAR EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
NNGAATTCNN
NNGAATTCNN
NNGAATTCNN
NNCTTAAGNN
NNCTTAAGNN
NNCTTAAGNN
NNGOH pAATTCNN
NNGOH pAATTCNN
NNGOH p AATTCNN
NNCTTAAp OH GNN
NNCTTAAp OHGNN
NNCTTAAp OHGNN
19
SITES METHYLES
ADN des eucaryotes peut être méthylé au niveau
des cytosines CpG. Certaines enzymes ne
reconnaissent pas l ADN méthylé
MspI ne coupe pas
Hpa II coupe
C C G G G G C C
C C G G G G C C
20
Sites 4 à 6 Paires de bases Coupure
fréquente 3kb
Sites 8 p bases Coupure rare 100-200kb
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LES OUTILS ENZYMATIQUES
I Hydrolyse des Acides Nucléiques
II Visualisation des fragments de restriction
III Utilisation des enzymes de restriction -
carte de restriction
I V Les autres enzymes
22
Visualisationdes fragmentsde restriction(électr
ophorèse)
Après coloration au BET
An Introduction to Genetic Analysis  
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
ADN génomique non coupé
ADN génomique coupé
ADN de phage (50kb) coupé
26
Nombre de kb (échelle Log)
Migration mm
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LES OUTILS ENZYMATIQUES
I Les enzymes de restriction
II Visualisation des fragments de restriction
III Utilisation des enzymes de restriction -
carte de restriction
I V Les autres enzymes
28
CARTE DE RESTRICTION
29
Enzymes de restriction
Fragments observés par électrophorèse
30
(No Transcript)
31
LES OUTILS ENZYMATIQUES
I Les enzymes de restriction
II Visualisation des fragments de restriction
III Utilisation des enzymes de restriction -
carte de restriction
I V Les autres enzymes
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LES AUTRES ENZYMES

• A - Les Polymérases
• - Les ADN Polymérases
• polymérase 1
• fragment de Klenow
• Taq polymérase
• Transcriptase reverse
• - Les ARN polymérases
• B Les Ligases
• C Les autres enzymes

33
ADN polymérases
?4 éléments nécessaires
34
IV - AUTRES ENZYMES

• Les polymérases
• Les ADN polymérases
• - LADN polymérase I
• - Le fragment de Klenow de la Pol I
• - La Taq polymérase
• - La transcriptase réverse
• Les ARN polymérases
• - Les ligases (ADN ligase, T4 DNA ligase),
• - Les autres enzymes

35
La ligation (ligature...)
La ligase est capable de lier de façon covalente
deux molécules dADN en une. Formation de
liaisons phospho Diester entre 3OH et 5P
Molecular Cell Biology
36
IV - AUTRES ENZYMES

• Les polymérases
• Les ADN polymérases
• - LADN polymérase I
• - Le fragment de Klenow de la Pol I
• - La Taq polymérase
• - La transcriptase réverse
• Les ARN polymérases
• - Les ligases (ADN ligase, T4 DNA ligase),
• - Les autres enzymes

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T4 Polynucléotide kinase
Phosphatase alcaline