S

1
Séquençage de lADN(méthode chimique selon
Maxam et Gilbert)
2
Préparation de lADN double brin
3
Radio-marquage en 5
P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OHHO3-T-T-C
-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5P
ATP radioactif(marqué au 32P)
Polynucléotide kinase
ADP 31Pi
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OHHO3-T-T-C
-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5 32P
4
Purification par une PAGE
5
Séparation des brins par thermodénaturation
32P5 -A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
HO3-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G- 5 32P
Chauffage
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
HO3-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5 32P

Séparation par une PAGE
6
Séquence dADN à déterminer
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
7
Fractionnement de léchantillon
ADN à séquencer
Tube 1
Tube 2
Tube 3
Tube 4
8
Ajout de réactif dans le tube 1
Réactif coupant spécifiquement avant G(dans
lordre 5P ? 3OH)
ATTENTION La réaction dhydrolyse est partielle
et aléatoire. Ainsi on obtiendra toutes les
fragments de brins possibles.
Tube 1
9
Les différents fragments possibles après
hydrolyse chimique partielle avant G
32P5-A-A ? G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T ? G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
On réalise une PAGE suivie dune
autoradiographie.Seuls les fragments radio
marqués seront localisables sur le gel. Ainsi on
identifiera
32P5-A-A-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3OH
et
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C- 3OH
10
Les fragments les plus petits migreront les plus
loin vers lanode ()
Pour ce cas on aura
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3OH32P5-A-A-3OH
11
Ajout de réactif dans le tube 2
Réactif coupant spécifiquement avant G ou avant
A (dans lordre 5P ? 3OH)
ATTENTION La réaction dhydrolyse est partielle
et aléatoire. Ainsi on obtiendra toutes les
fragments de brins possibles.
Tube 2
12
Les différents fragments possibles après
hydrolyse chimique partielle avant G ou avant A
32P5-A ? A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A ? G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C ? A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T ? G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G ? A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
13
On réalise une PAGE suivie dune
autoradiographie.Seuls les fragments
radiomarqués seront localisables sur le gel.
Ainsi on identifiera
32P5-A-3OH
32P5-A-A-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3OH
et
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
14
Les fragments les plus petits migreront les plus
loin vers lanode ()
Pour ce cas on aura
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A-
G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C
-T-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-3OH32P5-A-A
-3OH32P5-A-3OH (attention, en pratique, ce
nucléotide nest pas identifiable, on le notera
A)
15
Résultats des deux co-migrations
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-
A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-
C-C-T-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-3OH32P5-
A-A-3OH32P5-A-3OH
16
Ajout de réactif dans le tube 3
Réactif coupant spécifiquement avant C (dans
lordre 5P ? 3OH)
ATTENTION La réaction dhydrolyse est partielle
et aléatoire. Ainsi on obtiendra toutes les
fragments de brins possibles.
Tube 3
17
Les différents fragments possibles après
hydrolyse chimique partielle avant C
32P5-A-A-G-T ? C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T ? C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A ? C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C ? C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A ? C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
18
On réalise une PAGE suivie dune
autoradiographie.Seuls les fragments radio
marqués seront localisables sur le gel. Ainsi on
identifiera
32P5-A-A-G-T-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH
et
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
19
Les fragments les plus petits migreront les plus
loin vers lanode ()
Pour ce cas on aura
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-
C-A-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-3OH32P5-A-A-G-T-3OH
20
Résultats des trois co-migrations
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A
-C-C-T-G-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3OH3
2P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-
A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-
T-3OH32P5-A-A-G-T-3OH32P5-A-A-3OH32P5
-A-3OH
21
Ajout de réactif dans le tube 4
Réactif coupant spécifiquement avant C ou avant
T (dans lordre 5P ? 3OH)
ATTENTION La réaction dhydrolyse est partielle
et aléatoire. Ainsi on obtiendra toutes les
fragments de brins possibles.
Tube 4
22
Les différents fragments possibles après
hydrolyse chimique partielle avant C ou avant T
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G ? T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T ? C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C ? T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T ? C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A ? C-C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C ? C-T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C ? T-G-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A ? C-3OH
23
On réalise une PAGE suivie dune
autoradiographie.Seuls les fragments radio
marqués seront localisables sur le gel. Ainsi on
identifiera
32P5-A-A-G-T-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3OH
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH
et
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
24
Les fragments les plus petits migreront les plus
loin vers lanode ()
Pour ce cas on aura
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C
-A-C-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3OH32P5-A
-A-G-T-C-T-C-A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-3OH32P5
-A-A-G-T-C-3OH32P5-A-A-G-T-3OH32P5-A-A-G-
3OH
25
La PAGE
Pour comparer il faut travailler dans les mêmes
conditions.Ainsi le gel est composé de quatre
pistes où seront déposés les quatre échantillons
partiellement hydrolysés chimiquement
26
Après électrophorèse
32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3OH32P5-A-A
-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A
-C-C-T-G-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3OH32
P5-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C
-A-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-C-A-3OH32P5-A-A-G
-T-C-T-C-3OH32P5-A-A-G-T-C-T-3OH32P5-A-A-G
-T-C-3OH32P5-A-A-G-T-3OH32P5-A-A-G-3OH32
P5-A-A-3OH32P5-A-3OH
27
Lecture de la PAGE
La séquence du brin
dADN se lie
horizontalement- de lanode ()
(correspondant au côté 5P)- vers la cathode
(-) (correspondant au côté 3OH)
32P5-X-A-G-T-C-T- C-A-C-C-T-G-A-C-3OH
28
Avantage et inconvénient
29
Exemple
Donner la séquence du nucléotide dont
lautoradiographie dune PAGE suivant la méthode
chimique de Gilbert et Maxam donne le profil
ci-contre
5PX-A-T-T-G-C-T-A-C-C-A-A-G-G-C-C-3OH
30

• Lycée Libergier, Stéphan Mazurier, libre de tous
  droits dutilisation.
• Merci pour vos suggestions.