ISBT

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Sécurité des IgIVquant aux pathogènes
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• Évaluation de lefficacité antivirale du procédé
  de fabrication

• Sécurité de lIgIV S/D

• Sécurité de lIgIV C

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Évaluation de lefficacité antiviraledu procédé
de fabrication
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Analyse complète du plasma
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Sécurité quant aux pathogènes Une approche
globale
Centre de plasmaphérèse
Donneur
Étape 2 de la sécurité Analyse des dons
Étape 1 de la sécurité Sélection
Étape 3 de la sécurité Mise en quarantaineet
retraçage
Étape 9 de la sécurité Pharmacovigilance
Étape 4 de la sécurité Analyse du poolde
plasma
Patient
Début de la fabrication
Étapes 5 et 6 de la sécurité Contrôle de la
qualitéBonnes pratiquesde fabrication
Fin de la fabrication
Étape 7 de la sécurité Inactivation
viraleÉliminationdes virus/de lEST
Étape 8 de la sécurité BPCContrôle du
conditionnement
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Analyse du plasma à deux niveaux

• Dons de plasma
• Dépistage des marqueurs viraux (antigènes/anticorp
  s)
• PCR (VIH, VHB, VHC, titre élevé de B19)

• Pools de plasma
• Dépistage des marqueurs viraux (antigènes/anticorp
  s)
• PCR (VHC, titre élevé de B19)
• Des tests PCR pour le dépistage du VHB, VIH
  dans des pools sont mis en uvre.

• dans 96 mini-pools de plasma

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Validation du procédé
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La clairance virale comprend

• LES ÉTAPES DINACTIVATION (p. ex.,
  solvant-détergent, abaissement du pH,
  pasteurisation)
• Utiles pour les agents pathogènes viraux

• LES ÉTAPES DÉLIMINATION (p. ex., précipitation,
  filtration, chromatographie sur colonne)
• Utiles pour les agents pathogènes viraux et lEST

Stratégie  Prendre tous les moyens qui
simposentpour accroître la sécurité des
produits dorigine biologiquetout en maintenant
lintégrité du produit.
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Élimination des agents pathogènes
Filtration
Chromatographie
Mélange de protéines


Les protéines et pathogènes non désirés demeurent
dans la colonne.




Protéine cible enrichie/purifiée
Effluent à teneur réduite en pathogènes
Mélange de protéines contaminées
Addition dagent(s) précipitant(s)
Précipitation
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Élimination du précipité contaminé
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Inactivation virale

• Inactivation physique
• Chaleur sèche
• Pasteurisation
• Rayons solaires (UVC)
• Inactivation chimique
• Solvant-détergent
• caprylate
• abaissement du pH

LUMIÈRE
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Évaluation de la réduction de linfectivité
obtenueavec le procédé de fabrication
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Établir une version à échelle réduite du procédé
de fabrication
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Validation du modèle pilote
Caractérisation du procédé Toutes les
versionsà échelle réduite du procédé de
productiondoivent être comparables sur le plan
biochimique.
pH Température Concentration Rendement
Élimination des impuretés
Échelle industrielle
Échelle clinique
Échelle pilote
Le modèle pilote à échelle réduite est une
représentation valide du procédé de production
les donnéessur la réduction virale sont
acceptables.
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Études de clairance virale
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Virus utilisés dans les étudesde validation
virale
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Expériences de clairance virale
Inoculation du virus
Étape de fabrication à échelle réduite
Mesure de linfectivité
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Détermination de la clairance viralepour une
étape du procédé
Virus au départ(inoculé dans le matériel
dessai)
Virus résiduel(subsistant après létape du
procédé)
Clairance virale
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La charge virale est mesurée en log
1 log 10 particules virales 2 logs 100
particules virales 3 logs 1 000 particules
virales 4 logs 10 000 particules virales
En général, de 6 à 8 logs de particules virales
sont utilisés pour évaluer la clairance virale.
On estime que le facteur de réduction virale est
significatif lorsquau moins 4 logs de
particules virales peuvent être éliminés ou
inactivés dansune étape donnée du procédé.
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Nos lignes directrices pourla clairance virale

• Virus à enveloppe
• ? 10 logs de particules virales
  inactivées/éliminées (10 000 000 000 de
  particules virales)
• 2 étapes permettant déliminer ? 4 logs

• Virus sans enveloppe
• ? 6 logs de particules virales inactivées/éliminée
  s (1 000 000 de particules virales)
• 1 étape permettant déliminer ? 4 logs

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Études de clairance de lEST
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Comparaison entre les virus et lEST
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Clairance de lEST

• Aucune transmission par le sang na été confirmée
  chez les humains.
• Résiste à linactivation.
• La clairance nécessite lélimination des prions.

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Test Western Blot
Procédé de fabrication
Réductionde léchelle
Preuve
Procédé expérimental
Inoculation Homogénat de cerveau à 10
Solutionde départ
Effluent
Séparation
Précipité
Précipité gtDéchets
Effluent gt Produit
Échantillon
Échantillon
Clairance de la PrPres Preuve Effluent
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Analyse de linfectivité de lEST
Inoculation de tissu cérébral à 1
Biodosage UI/mL
108
107
106
105
104
103
102
101
100
Lanalyse de linfectivité permet de vérifier la
clairance du prion mesurée par le test Western
Blot.
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LEST est présentedans de nombreuses espèces
EST humaine
Kuru
MCJ classique SGSS, IFF, PS
Nouvelle variantede la MCJ (ESB)
Protéine Prion PrPSC
EST des rongeurs Hamster, souris
EST bovine ESB
EST des cervidés Cachexie chronique
EST ovine Tremblante du mouton

• Associée à linfectivité
• Résistance partielle à la protéinase K
• Masse moléculaire  33 à 35 kd
• Similarité de structure

EST féline Chats
EST du vison ETV
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Séparation identique des protéines prions
Toutes les formes de protéines prions humaines et
ovines ont un comportement identique à celui de
la protéine prion du hamster lors des techniques
de séparation!
MCJ classique ou vMCJ
Ces études indiquent que la séparation ou
lélimination des prions déterminée sur des
modèles animaux est indicatrice de la séparation
ou de lélimination des prions humains présents
dans la MCJ classique ou la vMCJ.
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Procédé de fabrication de lIgIV-S/D
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Fractionnement de Cohn-OncleyPâte Fr II III
Fr
.IIIII-Paste
Précipitation sélective des protéines
plasmatiquesen fonction de la concentration de
léthanol, du pHet de la température
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Procédé IgIV-S/D Daprès le fractionnement de
Cohn Pâte Fr II III
Fr
.IIIII-Paste
Koate
Konyne
Suspension
Suspension
Pâte II III
Pool de plasma
Prolastin/ATIII
Centrifugation
Albumine/ protéines plasmatiques
Précipitation à lalcool
Centrifugation
Filtration
UF/DF
Incubation S/D
Filtration
UF/DF
Chromatographie hydrophobe
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Le procédé IgIV-S/D comporte desétapes offrant
une élimination et uneinactivation
significatives des pathogènes
Séparation des Fr II III
Cryo- séparation
Pool de plasma
Séparation de la Fr I
Autres procédés
Séparation des Fr II IIIw
Élimination de lEST
Séparation de la Fr III
Élimination des virus
Filtration
Solvant- détergent
Inactivation des virusà enveloppe
Faible pH
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IgIV-S/D
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IgIV-CProcédé de fabrication
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Linactivation des virus à enveloppeest un
ajout au procédé IgIV-S/D
La pâte Fr II III est obtenuepar précipitation
à lalcool.
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Centrifugation
Centrifugation
Purification de lIgGpar précipitation à lalcool
Alcohol Precip.
Précip. à lalcool
Centrifugation
Centrifugation
Filtration
Filtration
Le S/D a été ajoutéau procédé de fabrication
de lIgIV.
UF/DF
UF/DF
S/D - Incub.
Incubation S/D
Filtration
Filtration
La chromatographie permet déliminer les produits
chimiques découlant du S/D.
UF/DF
UF/DF
Chromatographie hydrophobe
HIC
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Caprylate

• Inactivation des virus à enveloppe

• Purification des IgIV

Solvant-détergent
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Le caprylate une méthode unique dinactivation
des virus à enveloppe
Acide caprylique (acide octanoïque)
Acide gras Masse moléculaire 144,21 Origine
végétale pKa 4,89
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Une fiche de sécurité établie
Le caprylate est utilisé depuis des années comme
stabilisant dans lalbumine.
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Le caprylate...
... entraîne la précipitation des protéines
contaminantes présentes dans la solution dIgIV.
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Purification par le caprylate
Immunoglobulines
Autres protéines
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Le caprylate lipophile non ionisé...
... est proposé pour favoriser la séparation de
la couche lipidique du virus.
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Inactivation du VDVB par le caprylate et par S/D
conformément aux conditions de fabrication de
lIgIV-S/D et de lIgIV-C
1 minute
2 heures
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IgIV Chromatographie
Fr II III Pâte
Suspension de la pâte Fr II III dans leau
Matières dans le caprylate 1 (précipitation des
impuretés)
Filtration sur tissu
Matières dans le caprylate 2 (inactivation des
virus à enveloppe)
Filtration en profondeur
Échange danions
UF/DF, vrac
Formulation à faible pH
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Dans le procédé S/D, la molécule IgGest
précipitée plusieurs fois.
Dans le procédé IgIV-C, la molécule IgG demeure
dans la solution pendant tout le traitement.
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Comparaison de IgIV-S/D et de IgIV-C
Ajouté Intégré
Susp. Fr II III
Susp. Fr II III
IgIV-S/D
Précip. caprylate etfiltration sur tissu
Éthanol froid et centrifugation
IgIV-C
Procédé classique de Cohn-Oncley (1949) avec S/D
Incubation caprylate etfiltration en profondeur
Éthanol froid et centrifugation
Échange danions 1 2
Filtration enprofondeur
UF/DF

• Pureté comparable ou supérieure
• Durée réduite du cycle
• Aucun solvant

Incubation S/D
Filtration enprofondeur
UF/DF
Chromatographiehydrophobe
UF/DF vrac
Vrac
Incubation pH 4,25
Incubation pH 4,25
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IgIV-C Inactivation des virus à enveloppe
Comprend une nouvelle étape et
une étape éprouvée.
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Abaissement du pH une méthode éprouvée pour
linactivation des virus à enveloppe
La formulation à faible pH de lIgIV-S/Da été
maintenue.
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Composantes des études de clairancevirale pour
lIgIV-C
- Validation - Robustesse - Vérification du
mécanisme
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Études de validation
Les études sont habituellement effectuées daprès
des valeurs de consigne cibles, et on présume que
la réduction virale est similaire tout au long du
traitement.
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Études de robustesse
Permettent de vérifier si le degré de réduction
virale est maintenu tout au long du traitement.
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Exemple de robustesse
Étape dincubation dans le caprylate Procédé
IgIV-C
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Inactivation robuste du VDVB compte tenu de la
concentration de caprylate
Linactivation complète du VDVB survient bien en
deçà de la valeur de consigne de 20 mmol de
caprylate.
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Inactivation robuste du VDVB par le caprylate
compte tenu du pH
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Inactivation robuste du VDVB par le caprylate
compte tenu de la température dincubation
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Inactivation robuste du VDVB par le caprylate
compte tenu de la concentration des protéines
Filtrat I faible en protéines Filtrat I
valeur de consigne Filtrat I riche en
protéines HBSS, pH 7 HBSS, pH 5,1
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Lincubation dans le caprylate
permet une inactivation robuste des virus à
enveloppe compte tenu

• des virus à enveloppe
• de la concentration en caprylate
• du pH
• de la température
• du temps dincubation
• de la concentration des protéines

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Indépendance des mécanismes
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Réduction virale à toutes les étapes du procédé
Étape A x logs Étape B x logs Étape C x
logs Étape D x logs Réduction virale totale y
logs avec le procédé

en présumant que chaque étape procède dun
mécanisme indépendant
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mais les différentes étapes dun procédé ne
sont pas toujours indépendantes
Additif
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Étapes couplées du procédé IgIV-C
Filtration en profondeur
Chromatographie
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Filtration en profondeur couplée à la
chromatographie sur colonne
Filtration en profondeur
Inoculation du virus
Mesurer le titre viral
Filtrat I
MC 2
Filtrat II
Mesurer le titre viral initial
caprylate
Filtre en profondeur CUNO
Filtrat II
Filtres en continu
Échangeur dions no 2
Échangeur dions no 1
Fractions IgG
Mesurer le titre viral
Chromatographie sur colonne
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Filtration en profondeur couplée à la
chromatographie sur colonne
Réduction du PVP (log10 DICT50)
Valeur de consigne
NON additif Les mécanismes se chevauchent
les chiffres de réduction globale ont été
rajustés.
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Lindépendance des mécanismes
a été évaluée à léchelle expérimentale.
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Chevauchement des mécanismes
Même si la réduction virale obtenue par la
filtration en profondeur nest pas établie, il
est probable que cette technique contribue à la
réduction virale globale par le procédé IgIV-C.
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Clairance des prions Procédé IgIV-C
Effluent I
Cryo-effluent
Effluent II III
Effluent IV-1
Séparation Fr I
Séparation Fr IV-1
Cryo- séparation
Séparation Fr II III
Pâte Fr I Déchet
Pâte Fr II III
Pâte Fr IV-1
Cryopâte
Inoculation
Éliminationde la pâte
Filtration sur tissu
Échantillon
Éliminationde la pâte
Filtration en profondeur
Chromatographie
? Western Blot ? 7,8 logs ? Biodosage ? 10,2 logs
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Réduction de lEST dans le procédé IgIV-C

• La clairance mesurée par le test Western Blot
  concorde bien avec la clairance déterminée par la
  mesure de linfectivité.
• La clairance de la PrPsc adaptée au rongeur
  concorde bien avec lélimination de la PrPMCJ
  humaine.
• Une élimination significative de lEST est
  observée lors du procédé IgIV-C.

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Sécurité des IgIV-C quant aux pathogènes

• A commencé par lidée daméliorer un très bon
  produit, Gamimune ---gt IgIV-C.

• On a simplifié le procédé en utilisant le
  caprylate à la fois comme une étape de
  purification et comme une étape dinactivation
  virale.

• La formulation à pH de 4,25, qui donne
  dexcellents résultats depuis plus de 10 ans, a
  été maintenue.

• Validation soignée de la clairance des
  pathogènes et de la robustesse de la clairance à
  chaque étape.

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Programme de sécurité de Bayer quant aux
pathogènes

• Analyse rigoureuse du plasma

• Intégration des étapes dinactivation et
  délimination

• Comprend des étapes délimination virale faisant
  appel à des mécanismes distincts

• Évaluation de la robustesse de la clairance des
  pathogènes

• Clairance des virus et des protéines prions

• Recherche et développement sur de nouvelles
  techniques dinactivation virale et de nouvelles
  méthodes de dépistage des prions

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