BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE

1
BIOTECHNOLOGIEPHARMACEUTIQUE
De léprouvette au produit final

• PHA 2501 Sciences Pharmaceutiques II
• Alain Garnier, Laboratoire doptimisation des
  bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver
  2010

La totalité du matériel présenté est disponible à
ladresse web http//www.gch.ulaval.ca/agarnier/
2
Définition et contexte

• Biotechnologie lapplication de la science et de
  la technologie aux organismes vivants, à dautres
  matériaux vivants ou non vivants, pour la
  production de savoir, biens et services. (source
  OCDE)
• Traditionnelle Utilisation de micro-organismes
  et denzymes sélectionnés pour produire des
  agents dintérêt Isolation d'agents à partir de
  sources biologiques.
• Contemporaine Utilisation de micro-organismes et
  denzymes modifiés, directement ou non, pour
  produire des agents dintérêt.

3
Les médicaments d'origine biologique

• Traditionnels
• D'origine animale produits sanguins, hormones,
  stéroïdes, catécholamines, prostaglandines,
  anticorps, insuline, vaccins
• D'origine végétale alcaloïdes, flavonoïdes,
  méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides
  cardiotoniques et coumarines, ac salicylique
• D'origine microbienne antibiotiques, enzymes,
  protéases, vaccins,
• D'origine virale vaccins

4
Les médicaments d'origine biologique (suite)

• Biopharmaceutique substance utilisée à des fins
  thérapeutiques ou diagnostiques, à base d'acides
  nucléiques ou de protéines, produites par des
  moyens autre que l'extraction directe d'une
  source biologique non-modifiée.
• Exemples
• Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX)
• Agents trombolytiques (activateur tissulaire du
  plasminogène)
• Hormones (insuline, hormone de croissance,
  gonadotrophine, etc)
• Facteurs de croissance (cytokines, interférons
  (IFN), interleukines (IL), érythropoïétine (EPO),
  facteur de croissance des colonies, )
• Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de
  surface de l'hépatite B, )
• Anticorps monoclonaux
• Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides,
  vecteurs viraux, microARN, ARNi, )

5
Seulement 12 des nouveaux médicaments sont
produits par synthèse/extraction
de médicaments approuvés ou en essais cliniques
en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
6
Plan

• Cibles
• Sources
• Produits/caractérisques
• Méthodes analytiques
• Développement de systèmes de production
• Construction/sélection
• Procédés de production
• Procédés de séparation

7
Cibles des biopharmaceutiques
DIAGNOSTIC/THÉRAPIE
Dépistage/ thérapie génique
ADN
Transcriptome/ ARNi
ARN
traduction
Protéome/ Anticorps, hormones
PROTÉINE
Syst immunitaire/vaccin Métabolisme/ Thérapie
cellulaire
Francis Crick, 1958 (source NCBI)
8
Sources de biopharmaceutiques

• Virus
• Bactéries
• Levures
• Moisissures
• Cellules animales
• Invertébrés
• Mammifères
• Primates non-humains
• Humaines
• Lignées établies
• Cultures primaires
• Cellules souches

9
Les virus
Vaccins ou vecteurs de thérapie génique

• Vaccins - exemples
• Influenza (GSK)
• Adénovirus 4 7 (Wyeth Pharma pour DoD, 105-106
  doses
• Aussi variole, rubéole, rougeole, oreillons,
  varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune,
  encéphalite japonaise, cancer, etc

10
Maladies traitées par thérapie génique
11
Vecteurs utilisés
12
Type de gènes employés
13
Phases cliniques
14
La thérapie génique
Rétrovirus
Adénovirus
La thérapie génique consiste à traiter une
maladie par le transfert de matériel génétique.
Les virus sont particulièrement bien adaptés pour
accomplir cette tâche.
15
Adénovirus cycle dinfection
16
Adénovirus les gènes
B Massie, IRB
17
Adénovirus évolution des vecteurs
B Massie, IRB
18
Adénovirus construction
R. Gilbert, IRB
19
Adénovirus production et utilisation
B Massie, IRB
20
Rétrovirus
- Rétrovirus sinsère dans le génome de la
cellule hôte - 3 familles de gènes gag
capside, pol polymérase, env enveloppe - On
manipule la protéine denveloppe pour altérer le
tropisme du virus
21
Rétrovirus cycle de réplication
22
Rétrovirus construction de lignée de production
23
Les autres outils génétiques

• Diagnostic
• Patron de digestion par enzymes de restriction
• Séquençage
• Hybridation
• FISH
• Gene chip
• qRT-PCR
• Autres phénomènes
• Épigénétique
• ARNi

24
Techniques analytiquesLidentification de
séquences d'ADN
La digestion de l'ADN avec des enzymes de
restriction, suivi d'une électrophorèse permet
une identification par la différence de taille
des fragments
Tiré de Microbiology 101, WSU
25
Lidentification de séquences (suite)
En réalisant des PCR sur des fragments d'ADN en
présence de désoxynucléotides et une alternance
de didésoxynucléotides, on parvient à
complètement séquencer l'ADN
26
Hybridation fluorescente in situ (FISH)
LE FISH est une technique de biologie moléculaire
d'hybridation in situ utilisant des sondes
marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et
utilisées sur des coupes en microscopie. Ces
sondes peuvent être utilisées sur de l'ADN ou de
l'ARN (sonde ADN), ou sur des protéines (sonde
anticorps). Le FISH est une technique de
cytogénétique permettant de voir des éléments à
l'intérieur de la cellule.
27
L'expression des gènes les biopuces
1- Comparaison de lexpression génétique de 2
échantillons cellulaires 2- Extraction de
l ARN 3- Réverse transcription avec des
nucléotides marqués par des fluorochromes
différents 4- Hybridation compétitive sur des
lamelles contenant des milliers
doligonucléotides différents connus 5- Lecture
des lamelles 6- Analyse des résultats
28
Les biopuces (suite)
Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes
(cliquez sur les images pour une explication
détaillée).
29
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
Cliquez sur l'image pour un lien vers une
simulation de la PCR
30
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
31
Épigénétique

• Le terme épigénétique définit les modifications
  transmissibles et réversibles de l'expression des
  gènes ne s'accompagnant pas de changements des
  séquences nucléotidiques. Les changements peuvent
  se produire spontanément, en réponse à
  l'environnement, à la présence d'un allèle
  particulier, même si celui-ci n'est plus présent
  dans les descendants
• Certains caractères épigénétiques hérités
  pouvaient être transmis lors de la réplication
  cellulaire (méiose), voire subsister d'une
  génération à l'autre pour des organismes
  multicellulaires.
• Les phénomènes épigénétiques constituent un
  programme qui déciderait quels gènes activer ou
  inhiber. Lenvironnement influence ces signaux
  épigénétiques qui peuvent ainsi subir de petits
  changements. Ces épimutations sont plus
  fréquentes que les mutations classiques de lADN.

• Phénomènes épigénétiques
• Paramutations
• Bookmarking
• Imprinting
• Gene silencing
• X chromosome inactivation
• Position effect
• Reprogramming
• Transvection
• Effet maternel

32
LARN anti-sens, interférent, micro-ARN
(Pour plus de détails, cliquez ici)
33
Exemple 1 Infectio Diagnostic

• Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm
  Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD)
  Diagnostics à Québec
• Identification génétique de bactéries pathogènes,
  de gènes de toxines et de gènes de résistance
  (Strep B, SARM, )
• Basé sur la sensibilité, la spécificité et
  l'ubiquité de l'amorce PCR
• Temps du test 1 hr

34
Exemple 2 Diagnocure

• La plate-forme technologique PCA3, un gène dont
  l'ARN messager est détecté dans la majorité des
  cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN
  messager n'est exprimé qu'à un très faible niveau
  dans la prostate normale et est absent des autres
  tissus normaux. PCA3 peut donc servir de marqueur
  tumoral et les molécules dérivées de sa séquence,
  ARN messager ou peptide, peuvent servir à la mise
  au point de divers produits de diagnostic ou de
  thérapie. La découverte du gène PCA3 est le fruit
  d'une collaboration entre DiagnoCure et
  l'Université de Nijmegen et DiagnoCure détient
  des droits mondiaux sur cette plate-forme
  technologique.
• La technologie DiagnoGeneMC est l'association de
  technologies pour la détection d'acides
  nucléiques et de séquences de gènes spécifiques
  au cancer. Les produits dérivés de cette
  plate-forme technologique contiennent trois
  trousses utilisées selon un protocole en trois
  phases. Une trousse contient des billes de silice
  pour la purification des acides nucléiques de la
  préparation cellulaire analysée. Une autre
  trousse contient des amorces, des séquences
  d'acides nucléiques spécifiques au cancer
  investigué, et les réactifs nécessaires à
  l'amplification isothermique des ARNs messagers
  isolés avec la première trousse et
  complémentaires aux amorces fournies. La
  troisième trousse sert à la détection
  immunoenzymatique du produit amplifié. Cette
  plate-forme technologique peut donc servir à la
  mise au point de trousses de détection de tout
  cancer pour lequel on connaît une séquence
  spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence
  avec Organon Teknika, DiagnoCure détient des
  droits mondiaux sur les technologies Boom et
  NASBA, pour tous les cancers.

35
Les protéines recombinantes (PR)

• 1ère insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly)
• 73 sur le marché en 2004, gt80 en essais cliniques
• Croissance de 65 entre 2004 et 2010 (52G/2010)
• InsulineEPOIFN 57 du marché
• Protéines glycosylées 60 du marché des PR,
  principalement mAb

36
Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le
système immunitaire pour réagir avec un antigène
donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées
de 2 paires de polypeptides, lune de 25kD
(chaîne courte, domaine variable), lautre de 50
kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne
courte est responsable de la spécificité de
lanticorps pour son antigène
37
Anticorps monoclonaux - applications

• 37 des nouvelles molécules thérapeutiques
  biologiques
• Identification/diagnostic
• Thérapeutique
• Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,...
• Dirigés contre une protéine spécifique, ils
  peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand
  ou déclencher une réponse immunitaire.
• Ils peuvent aussi être liés à un agent
  chemothérapeutique, radioactif ou autre pour
  augmenter leur effet.

38
Exemple Agent anti-angiogénétique (Laboratoires
Aeterna)
Le processus de langiogénèse, soit la formation
de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important
dans le développement de la tumeur cancéreuse.
Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les
agents isolés par Aeterna proviennent de
laileron de requin. La prochaine étape consiste
à isoler les gènes responsables de la synthèse de
ces agents et de les cloner dans des
micro-organismes.
39
Les cellules thérapeutiques

• Cellules du sang cellules souches
  hématopoïétiques, Lymphocytes, Mégakaryocytes,
  plaquettes (Hema-Québec)
• Cellules musculaires (myoblastes, Jacques
  Tremblay, CHUL)
• Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins,
  Hopital du Saint-Sacrement, LOEX)
• Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau
  canadien sur les cellules souches,
  http//www.stemcellnet.ca) travaux sur le
  traitement du diabète, la maladie de Parkinson,
  l'insuffisance cardiaque, la dystrophie
  musculaire, la cécité, etc

40
Les cellules souches hématopoïétiques
41
Les cellules souches embryonnaires
42
Les cellules souches adultes
43
Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)

• Prévalence 1 garçon/3500
• Espérance de vie 20 ans

44
Thérapie cellulaire de la DMD

• Essais cliniques phase 1
• 3x1010 cellules/kg à traiter
• Équivalent 100g muscle donneur /kg à traiter
• Multiplication in vitro incontournable
• Volumes de culture 30L/kg à traiter
• Prérequis
• Milieu de culture efficace et sécuritaire
• Bioprocédé à grande échelle (en développement)

45
Caractéristiques des protéines épissage
Exemple Nyman et al (1998), "Identification of
nine interferon-a subtypes produced by Sendai
virus induced human peripheral blood leucocytes".
Biochem J, 329295-302.
Source U Miami, cours BIL150
46
Caractéristiques des protéines structure
Thèse PhD, François GUILLONNEAU, 2002
47
Caractéristiques des protéines les modifications
post-traductionnelles

• Clivage
• Pont S
• méthylation, phosphorylation, glycosilation
• conformation
• ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

Tiré de PHK
48
Analyses protéique et cellulaire

• Analyse de protéines
• activité
• ELISA
• Électrophorèse 1D, 2D, capillaire
• Chromatographie liquide (HPLC)
• Spectrométrie de masse
• Analyse cellulaire
• Immuno-histo-chimie
• Cytométrie en flux
• Imagerie cellulaire en temps réel
• Systèmes robotisés

49
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
50
Électrophorèse sur gel

• SDS-PAGE

Transfert sur membrane de nitrocellulose et
révélation avec marqueur spécifique Western EP
anticorps spécifiques à protéines Southern EP
ADN marqué Northern EP ARN marqué
51
Électrophorèse SDS-PAGE
Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2.
Fractionation of purified retroviral vector
preparations by 1D Gel ElectrophoresisPurified
virus preparations with (a) and without (b)
subtilisin treatment were fractionated on a 4-12
Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run
under reducing conditions and visualized by
silver staining. Protein bands from gel b were
excised and subjected to in-gel tryptic digestion
prior to MS/MS analysis. Bands containing
statistically significant peptide identifications
(A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the
protein profiles of samples a (green) and b
(blue) superimposed. The theoretical migration
positions of all MoMLV viral-encoded proteins are
indicated in figure c.
52
Gel délectrophorèse 2-D
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
53
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

• Échange dions
• Tamis moléculaire
• Interaction hydrophobe
• Phase inverse
• Électrophorèse

• Automatique
• Réfrigéré

Échantilloneur
Réservoir de Phase mobile
Pompe
Colonne
Détecteur
Collecteur de fraction
Échantillon

• UV/visible
• Fluorescence
• Infra-rouge
• Indice de réfraction
• Conductivité
• Spectrométrie de masse

• En fonction
• de la colonne
• Gradient

54
Hydrolysat trypsique de la BSA
55
Spectrométrie de masse (MS) - interface

• L'électro-atomisation (electro-spray ionisation,
  ESI)

"Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002
John B Fenn
56
MS domaines d'application
L'électro-atomisation à pression atmosphérique
(API-electrospray) permet l'analyse de protéines
57
MS - analyseurs

• Constitué de
• une source d'ionisation
• un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions
  produits selon leur rapport m/z
• un détecteur qui compte les ions et amplifie le
  signal
• un système informatique pour traiter le signal

Secteur magnétique
58
MS - Quadrupole

• m/z 10-4000
• Précision m/z 0.1-0.2
• Vitesse de balayage 5000 m/z par sec
• Le temps de vie dun ion de sa formation à sa
  détection 40-100 µs.

www.bris.ac.uk
59
MS - Temps denvol (TOF)

• Lincorporation dun réflectron dans le tube du
  TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et
  Cotter, 1994 Cotter et al., 2004)
• TOF est communément employé avec MALDI, il peut
  aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et
  Whitehouse, 1992)

www.chemistry.adelaide.edu.au
60
LCMS exemple d'appareil
Agilent 1100 MSD API-ES, quadrupole
61
MS exemple de résultat

• Myoglobine, MM 16951 Da
• Le résultat obtenu est un spectre de masse
  représentant les rapports m/z des ions détectés
  sur l'abscisse et l'abondance relative de ces
  ions sur l'ordonnée
• Le spectre est le résultat de la distribution de
  charges sur la population moléculaire
• Permet d'analyser qualitativement et
  quantitativement la protéine d'intérêt

62
Analyse de protéines par MSMS
Nomenclature de la dissociation en fragments
proposée par Roepstorff, 1984
(Yates, 1998 Westermeier et Naven, 2002 Graves,
2002)
63
Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L),
souvent utilisée en milieu de culture de cellules
de mammifères
64
Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

gtP02769ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus
(Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGE
EHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKS
LHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHP
YFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQ
RLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC
CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL
GSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDK
LKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE
VSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLF
TFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVD
KCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids 594 Molecular weight
68026.9 Theoretical pI 5.77
Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org)
65
Albumine fragments trypsiques
position mass peptide sequence position mass peptide sequence
25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK
29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK
37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK
66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR
76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR
89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK
101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK
106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK
118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK
123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR
131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR
139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER
157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR
161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK
169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK
184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR
198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK
205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK
212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK
223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK
229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK
236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK
249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK
257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK
267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK
281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA
286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK      
66
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, cliquez ici
Identification de protéine, cliquez ici (Logiciel
Mascot, Matrix Science)
67
Protéomique du sérum sanguin

• 60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)
• 10 000 protéines différentes
• 22 protéines 99 de la quantité protéinique du
  sérum (Zhang et al., 2005)
• 12 log de variation de concentration (Anderson et
  Anderson, 2002 Zhang et al., 2005)
• 325 protéines identifiées en 2003 (Pieper et al.,
  Proteomics, 3 1345-1364)
• 3020 protéines identifiées en 2005 (Omenn et al.,
  Proteomics, 5)

Tirumalai et al., 2003
68
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
69
Analyse cellulaire
Le compteur de Coulter enregistre un signal
provoqué par une modification du champ électrique
établi au travers dun orifice au travers duquel
un fluide contenant les particules est aspiré. Ce
signal est proportionnel au volume des
particules.
Exemple distribution de tailles de particules
pour deux échantillons différents
70
Immuno-histo-chimie
Technique utilisant des anticorps spécifiques
liés à des fluorochromes pour mettre en évidence
une protéine présente sur une cellule ou un
tissu. L'échantillon est par la suite observé en
microscopie à fluorescence
Distribution d'histones, de peroxisomes, et
d'actine dans une culture de cellules Vero,
Olympus
71
Cytométrie en flux
Technique permettant d'analyser des cellules à
grande vitesse en les faisant passer une à une
dans le faisceau d'un laser. La lumière ré-émise
(par diffusion ou fluorescence) permet de classer
la population suivant plusieurs critères et de
les trier. En anglais Flow cytometry ou
Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
72
Exemple de cytométrie en flux
73
Imagerie cellulaire en temps réel
Chambre thermostatée, humidifiée et à
concentration en CO2 controlée, montée sur la
platine du microscope
Exemple suivi de la division et de la
polyploïdisation de cellules mégakaryocytaires
sur 12 hrs (cliquez ici)
74
Sytèmes robotisés

• Composés
• D'unités de gestion des liquides (Liquid handling
  stations)
• De bras robotisés
• D'incubateurs automatisés
• De lecteurs

(Système Xiril, cliquez ici)
75
Développement de systèmes de production

• Établissement de lignées cellulaires
• Construction/sélection
• Procédés de production
• Procédés de séparation

76
Types de cellules animales

• Culture primaire Culture initiale de cellules
  qui viennent dêtre prélevées dun tissu.
  Différenciée. Généralement à attachement
  obligatoire (ADC).
• Culture secondaire Propagation dune culture
  primaire. Création dune lignée cellulaire. Peut
  être cultivé en suspension. Peut être
  indifférencié. Durée de vie limitée (30-50
  divisions).
• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
  transformée. Peut être cultivée en suspension.
  Durée de vie illimitée.

77
Différentes lignées

• MRC5, W138 secondaires, fibroblastes, poumons
  humains, adhérentes, vaccins
• HeLa cancer cervical humain (Helen La...),
  stable, adhérentes, recherche
• CHO ovaire de hamster chinois, stable,
  adhérente/suspension, versatile
• Vero reins de singe verts africains, stable,
  adhérente, versatile
• Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système
  dexpression baculovirus
• HEK-293 embryon de rein humain, transformée par
  fragment dadénovirus, stable, hôte dadénovirus,
  adaptée à la suspension (293S)

78
Exemple historique du développement de la lignée
HEK-293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 3659-72, 1977
79
La construction d'un système d'expression
transformation/transfection/transduction

• Introduction d'ADN exogène sous la forme d'un
  plasmide dans des cellules procaryotes
  (transformation) ou eucaryotes (transfection)
• Les cellules manipulées pour accepter un ADN
  étranger sont dites compétentes
• Différentes méthodes
• Phosphate de Calcium
• Liposomes
• Polycations (ex polyéthylène imine, PEI
  DEAE-Dextran)
• Électroporation
• Gene gun
• Transduction introduction d'ADN exogène par le
  biais d'un virus (procaryote)
• STABLE OU TRANSITOIRE

Access Excellence
80
La cassette d'expression

• Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences
  contrôlant leur expression
• Promoteur (constitutif inductible lac, cumate,
  T, etc tissu spécifique)
• Phase ouverte de lecture (Open reading frame)
• Séquence de polyadénylation (PolyA)
• Transactivateurs
• Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, )
• Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent
  être intercalés entre plusieurs ORFs

81
Autre exemple la co-transfection dun plasmide
et dun adénovirus dans la lignée cellulaire 293
pour produire un adénovirus recombinant
B. Massie, IRB
82
Sélection (Screening)

• Commencer par une expression transitoire
• Sélectionner en fonction
• Résistance à l'agent de sélection
• Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la
  protéine d'intérêt
• La stabilité de l'expression
• La qualité du produit (analyse crystalographique,
  RMN, MS, patrons de glycosylation, activité,
  stabilité, pharmacocinétique)

83
Les systèmes dexpression

• Modifications post-traductionnelles poussées
• Produit plus stable
• Milieu de culture complexe
• grande fragilité des cellules
• Coûts élevés
• Produits à haute valeur ajoutée

• Bactéries (1-3 um)
• Levures
• Fungi
• Cellules animales (10-20 um)

Critère de sélection choisir le système le plus
simple qui va faire le travail!
84
Exemple de milieu de culture de cellules de
mammifères Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)

• Sels (mg/L)
• CaCl2 200.00
• Fe(NO3)3.9H2O 0.10
• KCl 400.00
• MgSO4 97.67
• NaCl 6400.00
• NaHCO3 3700.00
• NaH2PO4.H2O 125.00
• Acides aminés (mg/L)
• Arginine 84.00
• Cystine.2HCl 63.00
• Glutamine 584.00
• Glycine 30.00
• Histidine 42.00
• Isoleucine 105.00
• Leucine 105.00
• Lysine.HCl 146.00
• Méthionine 30.00
• Phenylalanine 66.00

• Méthionine 30.00
• Phenylalanine 66.00
• Serine 42.00
• Thréonine 95.00
• Tryptophane 16.00
• Tyrosine.2Na.2H2O 104.00
• Valine 94.00
• Vitamines (mg/L)
• Ca.pantothénate 4.00
• Chlorure de choline 4.00
• Acide folique 4.00
• Inositol 7.20
• Niacinamide 4.00
• Riboflavine 0.40
• Thiamine.HCl 4.00
• Pyridoxine.HCl 4.00
• Autres (mg/L)
• Glucose 4500.00
• Rouge de phénol 15.00

composants non-définis sérum sanguin (5-15),
cocktail de facteurs de croissance, etc.
85
Comparaison des différents systèmes dexpression
86
Difficulté supplémentaire

• Temps de division augmente avec la taille
• Les cellules animales nécessitent des conditions
  dasepsie très strictes
• Adhésion obligatoire
• Certaines lignées de cellules de mammifères
  nécessitent un support pour être viables. Cela
• pose un problème de mise à l échelle
• les rend particulièrement susceptibles au
  cisaillement

Ex tapis cellulaire de myoblastes
Culture sur microporteurs
87
Exemple Culture de myoblastes - test de
différents microporteurs
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin,
M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast
Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1)63-74.
88
Culture de myoblastes - transfert de particule à
particule
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin,
M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast
Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1)63-74.
89
La production

• Le bioréacteur
• Les paramètres
• Les cinétiques de croissance des micro-organismes
  et de production
• Les modes de production

90
Bioréacteurs
Gracieuseté B.Braun
Laboratoire doptimisation des bioprocédés (LOB,
U. Laval)
91
Bioréaction les paramètres

• Température
• pH
• composition du milieu
• Agitation
• Aération
• Asepsie

92
Contrôle des paramètres
93
Optimisation des paramètres
94
Effet de la température sur la production
dadénovirus recombinant en 293S
Jardon et Garnier, 2000
95
Les cinétiques de croissance et de production
Le modèle le plus simple
(bilan sur les cellules)
(cinétique de Monod)
(bilan sur le substrat)
(modèle de Luedeking-Piret pour le produit)
La solution
X concentration cellulaire S concentration en
substrat limitant P concentration en produit
dintérêt ? taux spécifique de croissance ?max
et Ks paramètres de l expression de Monod
Yx/s coefficient de rendement cellule/substrat
??, ? coefficient de la relation de
Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les
concentrations en substrat et en cellules
initialement. Xmax Yx/s S0X0.
96
Simulation à partir dun modèle simple
Cuvée, ?MAX 1,16h-1, KS 4 g/L, YX/S 0,5
g/g, ? 0,4 g/g, ? g/(g.h)
97
Autres cinétiques

• Inhibition par le substrat
• Inhibition par le produit
• ...

98
Les modes dopération
X, P
99
Culture en perfusion
Figure 4. Fluorescence of 293S cells during
infection with adenovirus ?, Control ?, B1
Perfusion 35oC ?, B2 Perfusion 35oC ?, B3
Perfusion 37oC X, T-flask. Cortin et al., 2002
100
Le traitement en aval (downstream processing)

• Les étapes
• séparation
• homogénéisation
• concentration
• purification

101
Séparation/Clarification

• Objectif séparer les cellules du surnageant et
  conserver la fraction dintérêt selon que le
  produit est intracellulaire ou extracellulaire
• Les méthodes usuelles
• centrifugation
• micro-filtration (0,1-0,45 um)

Filtres à fibres creuses (AG tech)
Grande échelle filtration tangentielle
Principe de centrifugation en continu
102
Homogénéisation

• Objectif briser les cellules pour récupérer un
  produit intra-cellulaire
• Moyen
• Gel/dégel
• Ultrason
• contraintes (stress) hydrodynamiques

103
Concentration

• Objectif réduire le volume
• Moyens
• Précipitation
• Ultra-centrifugation
• Ultra-filtration (5kDa - 500kDa)

AG technologies
104
Purification

• Objectif Isoler le produit dintérêt
• Moyen chromatographie

Access Excellence
105
Purification (suite)
3 types de chromatographie
Access Excellence
106
Le contrôle de qualité

• Les molécules biopharmaceutiques sont soumises
  aux mêmes normes que la fabrication de molécules
  de synthèse
• Bonnes pratiques de fabrication (GMP)
• Protocoles dopération normalisés (SOP)
• Validation des procédés
• Documentation
• Ces normes sont appliquées de façon encore plus
  stricte pour les produits biologiques étant donné
  que les réactions menant à la formation du
  produit (le métabolisme cellulaire) ne sont pas
  bien définies.

107
Le contrôle de qualité (suite)

• Toute une série de normes, lignes directrices et
  de points à considérer  sont émis par le
   Center for Biologics Evaluation and Research 
  (CBER) de la Food Drug Administration  (FDA)
  http//www.fda.gov/cber/
• Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code
  of Federal Regulations" (CFR)
• "Guidelines" et "point to consider 
  particulièrement pertinents
• "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene
  Therapy"
• "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for
  Preventative Infectious Disease Indications"
• A proposed Approach to the Regulation of Cellular
  and Tissue-based Products

108
Le contrôle de qualité (suite)

• Classent le processus de production GMP en 7
  catégories
• Installation
• Équipement
• Personnel
• Matériels
• Protocoles
• Tests
• Documentation