Utilisation du Cryo-SEM pour l

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Utilisation du Cryo-SEM pour létude du
fonctionnement hydraulique des plantesHervé
Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA,
Clermont-Ferrand
3èmes Journées de formation du Réseau des
Centres Commun de Microscopie Université de
Rouen- Maison de luniversité 3 et 4 Juin 2004
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Le Cryo-SEM en qqes mots

• SEM classique (Philips SEM 505)
• Étage cryogénique T lt -80C (Hexland CT 100)
• Observation
• Métallisation
• En dessous du point de sublimation de la glace
• Observation déchantillons hydratés mais congelés
• Hypothèse le mode préparatoire des échantillons
  ne perturbe pas leur observation (méthode directe)

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Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Photos C Bodet
Épiderme dune feuille
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Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Coupe dune feuille (cryo-fracture)
Photos C Bodet
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Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Anatomie dune aiguille de Pin
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Circulation des sèves dans larbre
Croissance de larbre
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Deux phénomènes à mettre en évidence
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Observation du xylème au SEMÉchantillons
prélevés et déshydratés
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Observation du xylème au cryo-SEMRisques de
sublimation de la glace(cryo-décapage ou
métallisation)
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Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons
prélevés puis congelés
LN2
Betula platyphylla, Utsumi et al 1998
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La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point
dobservation
Pétiole de Noyer
Nombre de vaisseaux embolisés
millimètres
Distance à la coupe
Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.
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Circulation de la sève brute
Feuilles Pompe aspirante
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Un système vasculaire sous tension (dépression)

• La sève brute est aspirée par
  dépression
• La  pompe aspirante  se désamorce
• Lappareil vasculaire sembolise

Sol Eau diluée
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Perturbation du contenu des vaisseaux lors du
prélèvement des échantillons
Lappareil vasculaire est constitué de conduits
de dimensions variables mais finies
Photo C Bodet, INRA-PIAF
vaisseau
Terminaison de vaisseau
La sève se retire sur toute la longueur des
vaisseaux
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Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons
congelés sur larbre puis prélevés
Cochard et al Plant Physiol 2000
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Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons
congelés sur larbre puis prélevés
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Le paradoxe du Cryo-SEM
10 µm
-0.7 MPa
-0.7 MPa
gt-0.03 MPa!
Les mesures de tension de sève sont-elles
erronées ?
Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?
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Importance du mode préparatoire des échantillons
Échantillons recoupés sous eau puis congelés
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Variations journalières dembolie dans un pétiole
de noyer
LN2
Water

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Vitesse de congélation des échantillons par LN2
T,C
LN2
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Étude des phénomènes de collapse
Collapsus des parois
Cochard et al, Plant Physiol 2004
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Mise en évidence du phénomène de collapse par
cryo-SEM dans des aiguilles de Pinus cembra
Aiguille bien hydratée
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Aiguille fortement déshydratée
Pinus cembra -4 MPa
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Aiguille très fortement déshydratée
Pinus cembra -4.6 MPa
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Importance du mode préparatoire des échantillons
Eau 2 min
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Conclusions

• Pour le xylème la fiabilité des observations est
  très dépendante de la préparation des
  échantillons.
• Possibilités dartéfacts et dinterprétations
  erronées des observations.
• Embolie recouper sous eau
• Collapse ne pas recouper sous eau !
• Hypothèse le mode préparatoire des échantillons
  ne perturbe pas leur observation ?