Fingerprinting techniky (molekul rn daktyloskopie) Obsah

1
Fingerprinting techniky

• (molekulární daktyloskopie)

2
Obsah

• Princip metod
• Charakter získaných dat
• Typy metod
• Proteiny
• DNA-fingerprinting
• AFLP

3
Princip metody

• Metoda Hrubé síly
• Získat velké množství molekulárních znaku
• Neoverovat jejich nezávislost
• Neoverovat jejich genetické pozadí

4
Charakter získaných dat

• Multilokusová data
• Distancní metody
• Fenetické metody?
• U vzdálenejších druhu vadí vysoké procento
  homoplasií
• Genetická identita, genealogická príbuznost,
  tokogeneze, fylogeneze príbuznejších taxonu

5
Obsah

• Princip metod
• Charakter získaných dat
• Typy metod
• Proteiny
• DNA-fingerprinting
• AFLP

6
Typy metod

• Rozdelení podle studovaných molekul
• Proteiny
• DNA
• Rozdelení podle výchozího materiálu
• Rozdelení podle metody frakcionace
• Rozdelení podle metody detekce

7
Proteinový fingerprinting Princip metody

• Izolovat smes proteinu
• Predfrakcionovat
• Separovat (elfo)
• Detekovat

8
Proteinový fingerprinting

• Komplexita výchozího materiálu
• Nativní materiál (sérum, bílek, homogenát)
• Extrakty (fenolový extrakt, vodný extrakt)
• Zpusob separace
• Elfo (PAGE, nitrocelulosa, agar)
• Metoda detekce
• Nespecifické barvení (CBB, stríbro)
• Semispecifické barvení (stríbro kovy)
• Specifické histochemické barvení (isozymy)

9
Proteinový fingerprinting
Proteinové extrakty z ruzných kultivaru pšenice
rozdeleny na PAGE a obarveny CBB
10
Izoenzymová analýza
Homogenát tachyzoitu Toxoplasma gondii
11
Výhody protein fingerprinting

• Relativne jednoduché a rychlé
• Kodominance znaku
• Zavedená metoda

12
Nevýhody protein fingerprinting

• Méne znaku
• Znaky mohou být selekcne významné
• Možnost ovlivnení i prostredím
• Materiál méne stabilní

13
DNA fingerprinting

• RFLP restriction fragment length polymorphism
• scnRFLP restriktasa fingerprinting na scnDNA
• RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
• AP-PCR arbitrarily primed PCR
• AFLP amplified fragments length polymorphism

14
DNA fingerprintingPrincip metody

• Izolovat DNA
• (snížit komplexitu)
• Nasegmentovat DNA (restriktázy, PCR)
• Separovat segmenty
• Detekovat

15
b
a
c
_ _ _

taxoprint
RFLP
RAPD
16
RFLP

• Nastríhání DNA pomocí restrikcních endonukleáz
• Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich
  kombinace
• Problémy s prílišnou komplexitou vzoru
• Snížení komplexity výchozí DNA
• Kvalita separace fragmentu
• Specificnost detekce zón

17
RFLP bakteriální DNA
Celková DNA po naštepení rozdelena na PAGE
a obarvena EtBr
18
RFLP bakterií (taxoprint)
DNA rozštepena, koncove oznacena, rozdelena na
PAGE a detekována autoradiograficky
19
RFLP chloroplastové DNA
Izolovaná cpDNA naštepena enzymy, rozdelena na
agarose a obarvena EtBr
20
scnRFLP PCR-amplifikovaných úseku cpDNA
21
RFLP mtDNA rostlin - krok 1
Celková DNA rozštepena, rozdelena na agarose,
obarvena EtBr
22
RFLP mtDNA rostlin - krok 2
DNA z agarosy preblotována na nylon,
hybridizována s mtDNA sondou a detekována
autoradiograficky
23
DNA-fingerprint ptací DNA
DNA rozštepena enzymy, rozdelena na agarosové
elfo, preblotována na nylonovou membránu a
detekována 33.15 sondou
24
Výhody RFLP

• Relativní jednoduchost a láce
• Velké množství dat
• Slušná reprodukovatelnost
• Kodominance znaku
• Multilokusový charakter
• Selekcní neutralita znaku

25
Nevýhody RFLP

• Potreba vetšího množství DNA
• Potreba kvalitnejší a cistší DNA
• Spíše pro príbuzné druhy
• Nekdy špatne citelné elektroforetogramy nutnost
  snižovat komplexitu DNA
• Znaky nemusí být nezávislé
• RAPD z technického hlediska lepší

26
RAPDPrincip metody

• Izolovat DNA (hlavne vycistit)
• Amplifikovat fragmenty pomocí náhodných PCR
  primeru
• Rozdelit fragmenty
• Detekovat fragmenty

27
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

• Amplifikace pomocí náhodných primeru
• Ruzné modifikace AP-PCR
• Ruzné metody zvyšování poctu znaku
• Kombinace primeru
• Restrikce enzymy
• Semiselektivní primery
• Transposomy
• Introny exony

28
RAPD DNA kvasinek
Po amplifikaci s náhodnými primery byly
produkty PCR rozdeleny na agarosové elfo a
detekovány EtBr
29
RAPD myši
DNA byla pred amplifikací štepena restrikcním
enzymem, PCR primery hybridizovaly s ALU
30
Výhody RAPD

• Cena
• Rychlost
• Univerzálnost
• Malé množství materiálu
• Nižší požadavky na kvalitu DNA
• Obrovské (libovolné) množství dat
• Kvalita elektroforetogramu

31
Nevýhody RAPD

• Typická fingerprinting metoda
• Nelze hodnotit znakove orientovanými metodami
• Použitelné jen u relativne príbuzných druhu
• Chybí kodominance
• Interference znaku
• Vliv kontaminující DNA
• Nízká reprodukovatelnost PCR
• Horší publikovatelnost výsledku

32
AFLP (amplified fragments length polymorphism)
EcoRI
Restrikce dvema enzymy
MseI
EcoRI adapter
EcoRI adapter
MseI adapter
Ligace adaptéru
Predselkcní primery
Predselektivní PCR
Selekcní primery
Selektivní PCR
33
AFLP 2
kapilárová elektroforéza
standard molekulární váhy
amplifikované fragmenty
34
Výhody AFLP

• Vysoká reprodukovatelnost výsledku
• Velké množství znaku
• Kodominance znaku
• Minimum falešných homologií
• Lze použít znakove orientované metody
• Dobrá publikovatelnost výsledku

35
Nevýhody AFLP

• Nákladnost kitu i prístrojového vybavení
• Složitost metody
• Spíše pro príbuzné druhy

36
Závery

• Fingerprinting techniky velmi vhodné pro
  vnitrodruhové studie a pro fylogenetiku na nižší
  taxonomické úrovni
• Výhodná cena a rychlost
• Multilokusový charakter dat
• Data zpracovávat distancními metodami!
• Nejvýhodnejší z hlediska výsledku RAPD, z
  hlediska publikovatelnost AFLP