Prezentacja programu PowerPoint

1
Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska Klinika
Gruzlicy i Chorób Pluc
Bakteriologia gruzlicy
Lódz 2003
2
Klasyfikacja pratków
Klasa - Schizomycetes
Rzad - Actiomycetales
Rodzina - Mycobacteriacae
Rodzaj - Mycobacterium
3
Mycobacterium tubeculosis complex
M. tuberculosis
M. bovis
M. microti
M. africanum
M. canettii
atenuowana forma M. bovis BCG
4
Podzial pratków atypowychwg Runyona
5
Materialy, w których poszukujemy pratkówu
chorych na gruzlice pluc
Plwocina spontaniczna
Popluczyny zoladkowe
Plwocina indukowana
Popluczyny krtaniowe
Specimeny bronchoskopowe
Bronchoaspiratmaterial z cewnikowaniamaterial
ze szczoteczkowaniaBALF
6
Metody wykrywania pratków
1.
Bakterioskopia
Met. Ziehl-Neelsena
Met. fluorescencyjna - auramina -
rodamina - oranz akrydyny
Wynik - pojedyncze pratki w preparacie
- pojedyncze pratki w poszczególnych polach
widzenia - liczne pratki w poszczególnych
p.w.
7
Bakterioskopia
Met. Bakterioskopii szybka, tania, o niskiej
czulosci i swoistosci
Nie odróznia pratków gruzlicy od pratków
atypowych, w tym saprofitycznych
8
2.
Metoda hodowli
Zloty standard w diagnostyce bakteriologicznej
gruzlicy
Czulosc 80-85 - wykrywa 10 pratków w 1 ml
badanego materialu
Swoistosc 98-100
Uzyskany ta metoda wzrost pratków umozliwia ich
dokladna identyfikacje
Wyhodowanie pratków umozliwia przeprowadzenie
testów lekowrazliwosci
Uzyskanie hodowli pratków umozliwia za pomoca
metod genetycznych przesledzenie lancucha
epidemiologicznego
9
Metoda hodowli
Najczesciej uzywane podloze to podloze
Lowensteina-Jensena
Pratki rosna wolno 3-8 tygodni
Ocena nasilenia pratkowania () - do 20
kolonii, wynik podawany jest liczba -
liczba kol. 20-100 - 100-200, wzrost
policzalny - powyzej 200 kol., wzrost
zlewny, niepoliczalny
10
Metoda hodowli
Pratki widoczne nierosnace bacillus visibles
non viables
Sa widoczne w badaniu mikroskopowym, ale nie
rosna na odpowiednich podlozach
Ich obecnosc laczy sie ze skuteczna
terapia Liczba ich wzrosla po wprowadzeniu
rifampicyny
11
Hodowla pratków w systemie Bactec 460
12
Metoda Bactec 460
Metoda jest szczególnie uzyteczna w wykrywaniu
pratków w materialach skapopratkowych

• plyn oplucnowy
• plyn mózgowo-rdzeniowy
• plwocina od chorych ze zmianami minimalnymi w
  plucach

Wzrost pratków wystepuje pod koniec pierwszego
tygodnia, test lekowrazliwosci trwa nastepny
tydzien (dotyczy leków pierwszej linii terapii)
13
Metoda MB/BacT
Pratki rosna na podlozu Middlebrooka 7H9, a
wytwarzany dwutlenek wegla powoduje zmiane
zabarwienia sensora umieszczonego w dnie butelki
z zielonej na zólta
Sygnal detekcyjny w sposób ciagly przekazywany
jest do komputera, który rejestruje intensywnosc
wzrostu pratków
14
Odsetek dodatnich wyników w róznych metodach
hodowli
15
Metody serologiczne
Odpowiedz humoralna w gruzlicy nie ma charakteru
ochronnego. Odpowiedz humoralna rosnie wraz ze
wzrostem zaawansowania zmian. Badania
serologiczne istotne w gruzlicy wieku dzieciecego
oraz pozaplucnej. Stosowana jest metoda ELISA
oceniajaca obecnosc przeciwcial w stosunku do
antygenu 38kDa i A60. Czulosc tej metody 30-70
(w plynie oplucnowym 50)
16
Metody genetyczne
1. Sonda genetyczna
Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji pojedynczej
nici kwasów nukleinowych z komplementarnym
lancuchem polinukleotydowym. Sondy moga byc
róznej dlugosci, znakowane sa izotopami i
wykrywane przy pomocy licznika scyntylacyjnego,
lub fosfataza alkaliczna i wykrywany w reakcjach
barwnych, lub za pomoca fluorescencji (oranz
akrydyny).
17
Metody genetyczne
2. Reakcja lancuchowa polimerazy (PCR)
PCR polega na wielokrotnej amplifikacji wybranych
odcinków genomu pratka
Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomosc
sekwencji nukleotydowej otaczajacej powielany
fragment tak, aby mozna uzyskac jego
komplementarny odcinek tzw. starter
(primer). Najczesciej powielanym fragmentem
genomu pratka jest sekwencja insercyjna IS 6110,
a w nastepnej kolejnosci IS 986, gen kodujacy
HSP 65 kDa
18
Metody genetyczne
Etapy reakcji lancuchowej polimerazy (PCR)
denaturacja w temp 95oC 1-3 min z uzyskaniem
pojedynczej nici DNA
dolaczenie w temp 50-72oC starterów (0,5 3 min)
synteza DNA przy pomocy termostabilnej polimerazy
Taq w temp 72oC (0,5 3 min)
Liczba cykli 30-40. Zamplifikowany produkt
wykrywa sie przy pomocy znakowanych sond.
19
Przebieg reakcji lancuchowej polimerazy
20
Metody genetyczne
3. Reakcja lancuchowa ligazy
Równiez swoista dla M. tuberculosis
complex. Amplifikuje sie sekwencja kwasu
nukleinowego kodujaca antygen b (PAB). Dwie pary
oligonukleotydowych znakowannych sond hybrydyzuja
z komplementarna nicia DNA. Termostabilna
polimeraza wypelnia brakujacy odcinek pojedynczej
nici DNA.
21
Metody genetyczne
Ligaza kowalencyjnie laczy dwie sasiadujace
sondy. Zamplifikowany produkt absorbowany jest
na mikroczasteczkach. Detekcja odbywa sie w
oparciu o reakcje fluorescencji w specjalnym
analizatorze.
22
Reakcja lancuchowa ligazy
23
Metody genetyczne
Reakcja lancuchowa polimerazy i ligazy
Wykrywa pratki M. tuberculosis complex zywe i
martwe. Srednia czulosc 70-100. W materialach
skapopratkowych waha sie pomiedzy 46 a
70. Dolna granica wykrywalnosci 10 pratków w
badanym materiale.
24
Metody genetyczne
4. Polimorfizm dlugosci fragmentów
restrykcyjnych (RFLP)
Identyfikuje poszczególne szczepy pratków,
wykorzystywana zwlaszcza w badaniach
epidemiologicznych. Ocenia ona ilosc oraz
umiejscowienie w genomie pratka sekwencji
insercyjnej IS 6110 (1355 par zasad).
25
Metody genetyczne
Etapy RFLP

• ekstrahowanie DNA z komórek pratków
• poddanie go dzialaniu enzymów restrykcyjnych
• rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych na zelu
  agarozowym
• przeniesienie rozdzielonego materialu na
  nylonowe membrany
• hybrydyzacja ze znakowanymi sondami
  komplementarnymi do 245 par zasad fragmentu IS
  6110
• odczyt komputerowy uklad i ilosc linii
• odpowiada wielkosci poszczególnych fragmentów.

26
Metody genetyczne
Warunkiem zastosowania w badaniach
epidemiologicznych okreslonego markera
genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej strony
- jego zmiennosc, wystepujaca wystarczajaco
szybko, aby szczepy niezwiazane lancuchem
epidemiologicznym byly rózne. Natomiast - z
drugiej strony powinien on byc na tyle staly,
aby szczepy polaczone ze soba byly identyczne.
Okres póltrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i
wydaje sie spelniac te wymogi.
27
Wynik metody RFLP
28
Gran Canaria
Am. J. Respir. Crit. Care Med.. 1994 r.
1991-1996 rok 960 chorych
Wsk. zap. 30
18 chorych 2 zachorowalow okresie co najmniej
12 m-cy
56 Reactivatio endogenes nie zakonczyli
leczenia opornosc na leki
44 Reinfectio egzogenes zakonczyli
prawidlowo leczenie
29
Metody chromatogaficzne
Chromatografia plynna wysokocisnieniowaHPLC
(High Preassure Liquid Chromatography)
Liczba i rodzaj kwasów mykolowych sa
charakterystyczne dla kazdego gatunku. Rozdzial
wyekstrahowanych kwasów mykolowych na specjalnych
kolumnach a uzyskane wzory elucyjne sa swoiste
dla danego gatunku pratka
30
lekoopornosc
pierwotna
wtórna
New York
N Engl. J. Med. 1999 r.
1987-1991 rok 17 chorych HIV pratkujacych w
posiewie co najmniej 1 rok
I grupa (ten sam szczep) zachowana wrazliwosc
na leki p. pratkowe
(ten sam szczep) lekoopornosc pierwotna i wtórna
4 chorychI-szy szczep zachowana wrazliwosc na
lekiII nowy szczep wielolekooporny (lekoopornosc
pierwotna wtórnie nabyta)
31
Lekowrazliwosc pratków

• W Polsce badanie lekowrazliwosci przeprowadza
  sie
• Metoda wskaznika RR (Resistance Ratio)
  minimalne stezenie leku hamujace wzrost szczepu
  badanego / minimalne stezenie leku hamujace
  wzrost szczepu H37RvRR gt 4 dla hydrazydu i
  strepromycynyRR gt 8 dla PAS
• Metoda proporcji z ocena krytycznego odsetka
  opornosci

szczepy oporne