Neues aus der Sepsis-Diagnostik

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Neues aus der Sepsis-Diagnostik
gt Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 lt

• Petra Apfalter

Klinische Mikrobiologie AKH Wien
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Kennen Sie dieses Szenario?

• Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient
• Infektion?
• Sepsis SIRS durch Infektion
• Wenn ja, welche?
• Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund
• Erreger, Empfindlichkeitsprofil

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Warum ist Sepsis-diagnostik wichtig?

• Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU
• Direkte Behandlungskosten in D 1,1 bis 2,45
  Milliarden Euro/Jahr
• Therapie oft empirisch
• 11 - 46 ICU Patienten initial falsch therapiert
  1, 2, 3
• Zeitfaktor essentiell für Outcome
• Letalität hoch (40)

1 Kollef M, Chest, 1999 2 Garnacho-Montero J,
CCM, 2003 3 Byl B, CID, 1999
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Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am
häufigsten aus?

• Lunge 44.0
• Harnwege 9.1
• Bauchorgane 8.6
• Wunden und Weichteile 6.6
• Katheter 2.2
• ZNS 0.8
• Herzklappen 0.6
• Andere (z.B. Sinus) 10.8
• Bakterien im Blut (positive Blutkultur) 17.3
• 
  (Angus DC, Crit Care Med
  2001 291303-1310)

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Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005
Krankenhaushygiene, AKH Wien
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Worum es heute geht

• Konventionelle Diagnostik
• Blutkultur (BK)
• Diagnostik - Neu
• PNA-FISH aus BK
• Light CyclerSeptiFAST aus EDTA-Blut
• rDNA-Sequenzanalyse
• Diagnostik - In Entwicklung
• Chip-Techniken

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Alt, aber gut die BK

• Blutmenge ist DER entscheidende Faktor!
• Bakteriämie
• Erwachsene lt1-10 KBE/ml
• Kinder 10-gt100 KBE/ml
• Gesamtvolumen 15-20 ml
  (Kinder 1-5 ml)
• Standard 1 aer. 1anaer. Fl. od.
  2 aer. Flaschen

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Wann BK abnehmen?

• Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis
  hinweisen
• Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines
  Antibiotika DI
• 2-3 Kulturen in rascher Folge
• Bei negativem Ergebnis nach 24h WH!
• Keine Überwachungs-BK
• Keine follow-up BK nach Diagnosestellung

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Diagnostischer Zeitrahmen BK
Empirische AB-Therapie
Anpassen De-Eskalieren
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 28 PILZE

Blutkultur
ID AB
Gram
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Worum es heute geht

• Konventionelle Diagnostik
• Blutkultur (BK)
• Neu
• PNA-FISH aus BK
• Light Cycler SeptiFAST aus EDTA-Blut
• rDNA-Sequenzanalyse
• In Entwicklung
• Chip-Techniken

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PNA-FISH

• Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ
  Hybridization
• Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit
  ribosomaler RNA
• Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h
• Für in vitro Diagnostik

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Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK - 1d
Empirische AB-Therapie
Anpassen De-Eskalieren
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 28 -gt PILZE

!
Blutkultur
ID AB
Gram
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PNA-FISH Target rRNA
Hoch konserviert 103-105 Kopien/Zelle (natürliche
Amplifikation) rRNA Sequenzen taxonomische
Referenz
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Schnell-ID positiver BK

• S. aureus PNA FISH

GPCC
C. albicans PNA FISH
Gram Fbg.
Yeast
GPCPC
E. faecalis PNA FISH
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Light Cycler SeptiFAST aus EDTA-Blut
Diagnostics

• Multiplex Real-time PCR am Light Cycler 2.0
  (Roche)

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The LightCycler? SeptiFast Test Hypothesis DNA
in human blood?
Diagnostics
PCR
Kultur
freie DNA
lebende Bakterien/Pilze
lebende Bakterien/Pilze
tote Bakterien/Pilze
phagozytierte Bakterien/Pilze
lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?)
human DNA
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The LightCycler? SeptiFast Test Target Region
Internal Transcribed Spacer
Diagnostics
Multiple specific HybProbe probes

• Spacer Region (ITS)
• Multiple copies
• Well investigated
• Especially suited for Species testing

• Ribosomal Genes
• Multiple copies
• Well investigated
• Especially suited for Group testing

• Single Copy Genes
• No enhancement
• Less investigated

ITS internal transcribed spacer
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Das HybProbe Prinzip

• 2 Sonden benachbart hybridisierendes Oligopaar
• Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander
  binden
• Sequenz-spezifische Detektion
• Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz
  durch Schmelzkurvenanalyse möglich!

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The LightCycler? SeptiFast Test Negative Control
/ Internal Control
Sample or
Negative Control
Diagnostics
- MagNA Lyser Instrument - Sample Preparation
Lysis
Internal Control
Purified NA
50 µl eluate each
LightCycler? Instrument
The LightCycler? SeptiFast Kit
Gram (-)
Gram ()
Fungi
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The LightCycler? SeptiFast Test Channel
distribution Gram ()
Diagnostics
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SeptiFast Master List
Gram (-)
Gram ()
Fungi

• Staphylococcus aureus

• Escherichia coli

• Candida albicans
• Candida tropicalis
• Candida parapsilosis
• Candida glabrata
• Candida krusei
• Aspergillus fumigatus

• Klebsiella
• (pneumoniae/oxytoca)

• CoNS 1

• Strep. pneumoniae

• Streptococcus spp. 2

• Serratia marcescens

• Enterobacter
• (cloacae / aerog.)

• Proteus mirabilis

• Pseudomonas aeruginosa

1 Coagulase Negative Staphylococci (Species
which represent the group are listed in the
PI). 2 Species which represent the group
Streptococcus spp. are listed in the PI. 3
Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii
are not detected.

• Acinetobacter baumannii 3

• Stenotrophomonas
• maltophilia

• Each bullet point represents a specific melting
  point, species in brackets are not differentiated

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Keimspektrum AKH Wien 2005
Sepi 25Sau 12
Krankenhaushygiene, AKH Wien
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Empirische AB-Therapie
Anpassen De-Eskalieren
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 28 -gt PILZE


!
Blutkultur
6 h
ID AB
SeptiFAST
Gram
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rDNA-Sequenzanalyse

• Real-time PCR Sequenzierung

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rDNA-Sequenzanalyse

• 16S rDNA für Bakterien
• 18S, 28S rDNA ITS1 2 Region für Pilze
• Direkt von Patientenprobe
• Amplifikation mit universellen Primern
• Sequenzieren der Amplicons
• Alignment mit Datenbank

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Zielgene
Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA

• Universelle Primer

rDNA Operon
16S rDNA universelles bakterielles
Gen Konservierte Regionen Primertarget Hypervari
able Regionen (zB V3) Phylogenetische Analyse
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Überblick Sequenzreaktion
Sequenzreaktion Aufreinigung

• MicroSeq Komponenten
• dRhodamine dye Terminatoren, cycle sequencing

A
dR6G
T
C
G
dROX
dTAMRA
dR110
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Analyse der Daten
Editieren der Sequenz
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TechnikAnfordern
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Worum es heute geht

• Konventionelle Diagnostik
• Blutkultur (BK)
• Neu
• PNA-FISH aus BK
• SeptiFAST aus EDTA-Blut
• rDNA-Sequenzanalyse
• In Entwicklung
• Chip-Techniken

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Microarrays

• Detektion hunderter Mikroorganismen simultan
  (100.000e Gene)
• Detektion wichtiger Resistenzgene
• Bestimmung von verschiedenen Genotypen,
  Mutationen
• Quantifikation möglich

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Oligo-shotgun-Chip
Austrian Research Center Seibersdorf
Cloning of interesting genes inE.coli ( plasmids)
genomic 16S rRNA gene- fragments
Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted
onto chip probes
Patterns of green spots identifyspecies
resistence present in sample
Hybridization
DNA extraction from specimen (incl. unknown
bacterial DNA) -gt PCR (whole bacterial DNA
tagged with Cy3)
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Diagnostischer Peptidchip

• Anwendung in Körperflüssigkeiten
• Simultane Detektion verschiedener Erreger
  ResistenzenProtein/Epitop am Chip detektiert
  spezifische Immunantwort

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Peptidchip - Strategie
Funded by Co-Operate Vienna Wiener
Wirtschaftförderungsfond

• Prediction of Bacterial Antigens in silico
• Whole genome
• B cell epitopes

• Collection of Sera
• Sera from patients (with
• bacterial infections)
• Sera from healthy persons

• Bacterial Epitope Identification
• Peptide Synthesis
• Peptide ELISA with Sera

• Validation of Antigens
• Peptide ELISA
• Peptide Chip

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