DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES
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• 1) Indications
• a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
• b ) Diagnostic de confirmation
• c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
• 2) Recherche de lanomalie génétique (en
  fonction du mode de transmission mendélien )
  diagnostic direct.
• a) problèmes posés par les mutations récurentes
• b) problèmes posés par les mutations inconnues
• i) diagnostic direct évident
• ii) validation de la responsabilité d un
  variant moléculaire
• 3) Analyse de la ségrégation d un haplotype
  polymorphe lié à l anomalie
• a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques
  (analyse indirecte et semi-directe)
• b ) analyse familiale
• c) diagnostic probabiliste

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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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Recherche de mutations récurrentes

• Un gène une mutation
• Un gène-des mutations majoritaires
• de nombreux outils adaptés

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Maladie de Huntington
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Diagnostic Direct et analyse fonctionnelleSyndrom
e de retard mental lié à l X

• Le Gène
• Gène FMR1, localisé en Xq27.3
• FMRP RNA binding protéine
• Présence d une expansion d un motif
  trinucléotidique répété  CGG  au niveau de
  l extrémité 5 non traduite du gène

(CGG)n
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Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié
à l X

• Southern Blot

Homme mosaïque
Femme mosaïque
Femme prémutée
Femme normale
Homme prémuté
Homme normal
Femme mutée
Homme muté
5,2 kb EcoRI normal
Muté Méthylé
NI
Prémuté No Méthylé
2,8 kb EcoRIEagI normal
NA
Interprétation des profils
Blot
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Diagnostic direct d une lésion de l ADN par PCR
Deux réactions permettent d amplifier
simultanément à l aide de 18 couples d amorces
spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine
et les jonctions introns-exons correspondantes. E
lles permettent ainsi de diagnostiquer la
délétion d un ou plusieurs de ces exons chez les
malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker.
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Oligonucleotide Ligation Assay
Ligationdénaturation
OLA Normal
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Oligonucleotide Ligation Assay
Ligationdénaturation
OLA muté
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OLA
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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Recherche de mutations inconnues

• Techniques multiples de détection

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PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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• Critères dimplication dune variation
  nucléotidique dans un phénotype (pathologique)
• évident (modification radicale de la protéine)
• Absence dARNm ou de protéine
• Perte de la fonction de la protéine in vitro ou
  dans un modèle (test fonctionnel)
• modification de lARNm
• Arguments probabilistes
• Histoire familiale
• corrélations mode de transmission/ phénotype
  phénotype/génotype
• Arguments biologiques (éventuellement in sillico)
• nature du changement dacide aminé
• éloignement du consensus pour une séquence signal
• ...
• Comparaison en population
• mutations comparables et leurs effets pathogènes
• conservation du résidu modifié dans une famille
  de gène (intraspécifique) ou une analyse
  phylogénétique (interspécifique)
• présence de la variation dans une population
  normale comparable

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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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Le Diagnostic Indirect
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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Diagnostic Indirect (affection AD)
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1) Indications a) Conseil génétique et
diagnostic anténatal b ) Diagnostic de
confirmation c ) Diagnostic prédictif
(présymptomatique) 2) Recherche de lanomalie
génétique (en fonction du mode de transmission
mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés
par les mutations récurentes b) problèmes posés
par les mutations inconnues i) diagnostic
direct évident ii) validation de la
responsabilité d un variant moléculaire 3)
Analyse de la ségrégation d un haplotype
polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs
polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse
indirecte et semi-directe) b ) analyse
familiale c) diagnostic probabiliste
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Phénomène de recombinaison
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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• Le consentement éclairé
• Obligatoire
• doit porter sur des renseignements précis
• doit faire lobjet dun document écrit
• doit être compris par le patient ou ses
  ayant-droits
• Les cas particuliers
• enfants
• les titulaires de lautorité parentale et
  éventuellement lenfant lui même
• les majeurs incapacités
• tuteur ou curateur
• les impossibilités
• personne de confiance déclarée
• famille
• Lattestation dobtention du consentement.

• Le consentement éclairé
• Unicité de la recherche
• Autorisation du laboratoire
• Découvertes fortuites
• Incertitude sur le succès
• Durée des examens
• Conservation des échantillons
• Modalités de rendu diagnostique
• Caractère facultatif

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• Abord du patient
• Lecture dun compte rendu danalyse moléculaire
  pour le praticien
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• Rendu des résultats
• par le médecin prescripteur du test
• qui est le seul destinatiare des résultats
• Au cours dune consultation appropriée
• Eventuel suivi
• Lecture dun compte rendu de diagnostic
  moléculaire à lusage du praticien
• Notion de nomenclature internationale des
  mutations

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Nomenclature des mutations

• Description au niveau nucléotidique
• Base de description
• la séquence génomique g.
• La séquence de lADNc c.
• Les substitutions
• g.11223GgtA substitution dune guanosine par une
  adénosine en position 11223 de la séquence
• c.542TgtC (le nucléotide N 1 est le premier
  nucléotide du codon dinitiation de la traduction
  (A de lATG))
• Cas des introns
• c.6412TgtA ou IVSn2TgtA
• c.642-1GgtT ou IVSn-1GgtT
• Séquence de référence précisée.
• Les délétions et les insertions
•  del  ou  ins 
• c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA

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• Description au niveau protéique
• p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X
• p.R40W ou p.Arg40Trp
• Description de mutation à effet plus complexe
• Exemple mutations décalantes du cadre de lecture
• c.642_643insCfsX18
• p.Ala214AlafsX6
• Lecture du compte rendu
• 1) la technique employée
• 2) le résultat brut
• Présence dune mutation c.24CgtT dont
  limpact protéique est p.Lys8Arg
• 3) le commentaire
• La mutation p.Lys8Arg présente à létat
  hétérozygote est décrite de manière récurente
  dans la population européenne. Elle est
  responsable du phénotype du patient. Elle se
  transmet en dominance et, sa présence doit faire
  conseiller une consultation spécialisée de
  génétique pour informer le proposant des risques
  et engager une éventuelle enquête familiale.

32

• Précisions, questions et description des
  mutations complexes
• http//www. dmd.mutnomen.html

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• Consentement de la femme enceinte

• Elle a eu et compris les informations suivantes
• Mode de pratique du DPN
• Nature et limite des examens réalisés
• Risques liés au prélèvement
• Délai dobtention des résultats
• Remise et explication des résultats
• Il ny a en acun cas un engagement à la
  réalisation dune interruprion de la grossesse si
  le fœtus est atteint de la maladie recherchée

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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CHORIOCENTESE et / ou
PLACENTOCENTESE

• Date - Choriocentèse 10 - 14 SA
• - Placento 15 - 35 SA
• Villosités annexes
• Risque - F.C. 1 à 1,5
• - erreur 1
• Intérêt - gène
• - chs
• - enzyme

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AMNIOCENTESE
aiguille
utétus

• Date 14 - 30 SA
• Cellules Amniotiques
• Risque - F.C. 0,5
• - erreur 1/10000
• Intérêt - gène
• - chs
• - enzyme
• - hormone

fœtus
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CORDOCENTESE

• Date 22 - 38 SA
• Sang Foetal
• Risque - F.C. 1
• - erreur 1/1000
• Intérêt - gène
• - chs
• - enzyme

aiguille
utérus
Cordonombilical
fœtus
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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• 4) Prescription
• a) consultation préalable appropriée
• b) obtention du consentement éclairé
• c) rendu des résultats
• 5) Le diagnostic anténatal
• a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
• b) obtention du consentement éclairé
• c) prise en charge de la grossesse en cours
• d) rendu des résultats
• e) linterruption volontaire de grossesse pour
  motif médical

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• Diagnostic dune maladie dune particulière
  gravité reconnue comme incurable au moment du
  diagnostic

• Prise de décision multidisciplinaire
• Néonatologiste
• Echographiste
• Obstétricien
• Généticien
• Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal

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• Références
• Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP
  READ, Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition
  française 1998)
• Génétique Médicale formelle, chromosomique,
  moléculaire, clinique. Collège National des
  enseignants et praticiens de Génétique Médicale,
  2004, MASSON
• Génétique Médicale formelle, chromosomique,
  moléculaire, clinique. Collège National des
  enseignants et praticiens de Génétique Médicale,
• http//college-genetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html