In situ hibridizaciis diagnostikuri SesaZleblobebi

1
In situ hibridizaciis diagnostikuri SesaZleblobebi
prof. g. burkaZe
2
upiratesoba molekuluri biologiis meTodebTan
SedarebiT ISH-is principi SesaZlebelia
nebismieri genis (birTvSi) an m-rnm-is
(citoplazmaSi) 10-20 aslis gamovlena.
gamosakvlev masalaSi nukleinis mJavebi ganicdis
denaturacias (orZafiani dnm xdeba erTZafiani) da
ukavSirdeba komplementuri Tanmimdevrobis Semcvel
moniSnul zonds. Sedegad warmoiqmneba orZafiani
hibriduli molekula (dnmdnm, dnmrnm an rnmrnm).
 
 
3
sakvlevi masala ISH-Tvis   1. citologiuri
masala 2. parafinis anaTlebi 3. gayinuli
anaTlebi 4. eqstragirebuli dnm
4
In situ hibridizaciis meTodika 1.
fiqsacia/preparireba fiqsatorebi 1.
precipitaciis gamomwvevi _ eTanoli, ZmarmJava.
precipitaciis gamomwvevi fiqsatorebis
gamoyenebisas moniSnuli zondebi qsovilSi advilad
aRwevs, magram SeiZleba gamoiwvion rnm-is
raodenobis Semcireba da qsovilis araoptimaluri
morfologia.
5
2. jvaredinad damakavSirebeli _ 1-4
paraformaldehidi, 10 neitraluri buferuli
formalde-hidi, glutaraldehidi. fiqsacia xdeba
04?C-ze endogenuri ribonukleazebis inhibiciis
mizniT, maqsimalurad swrafad (30
wuTSi). preparireba gulisxmobs citologiuri
masalis sasagne minaze ganTavsebas, histologiuri
masalis parafinSi Cayalibebas, gayinul anaTlebs,
eqstragirebul dnm-s.
6
2. SeRwevadoba formalinSi fiqsacia amcirebs
reaqtivebis SeRwevadobas ujredebSi, risTvisac
gamoiyeneba SeRwevadobis gamaZlierebeli mravali
reaqtivi, mag., HCl da sxvadasxva tipis
proteinazebi.
7
3. hibridizacia sakvlev masalaSi jer xdeba
nukleinis mJavebis denaturacia, ris Sedegadac
orZafiani dnm xdeba erTZafiani, Semdeg ki xdeba
hibridizacia. hibridizacia gulisxmobs
denaturaciis Semdeg samizne nukleotidebis
Tanmimdevrobis gawyvilebas moniS-nuli dnm- an
rnm-zondebSi Semavali nukleotidebis
TanmimdevrobasTan, anu isev warmoiqmneba
orZafiani molekula dnmdnm, dnmrnm, rnmrnm.
8
(No Transcript)
9
zondis SerCeva zondebis SeqmnisTvis
gamoiyeneba   klonirebuli dnm.   genomuri
dnm.   sortirebuli qromosomebi.   PCR-iT
amplificirebuli dnm.   sinTezuri
oligonukleotidebi.   gameorebadi
dnm-Tanmimdevrobebi.   ribozondebi
(rnm-zondebi).  
10
zondis tipebi 1. orZafiani komplementuri dnm
(cDNA). 2. erTZafiani cDNA. 3. rnm zondi
(ribozondi). 4. oligonukleotidebi. yvelaze
xSirad gamoiyeneba orZafiani zondebi, magram Tu
saWiroa maRali mgrZnobeloba, maSin gamoiyeneba
erTZafiani zondebi.
11
moniSvnis SerCeva moniSvnis SerCevis ori
varianti arsebobs 1. radioaqtiuri moniSvna
(33P, 35S, 3H) 2. araradioaqtiuri moniSvna
12
radioaqtiuri moniSvnis upiratesobani   maRali
mgrZnobeloba.   zondiT moniSvnis efeqturobis
advilad kontroli.  radioizotopebis inkorporacia
advilia dnm-Si da rnm-Si mravali enzimebis
saSualebiT.   SesaZlebelia naxevradraodenobrivi
Sefaseba. uaryofiTi mxareebi 1. radioaqtiuri
narCenebis zemoqmedeba. 2. SeRebvis
arastabiluroba. 4. vizualizaciis siCqare. 5.
SedarebiTi siZvire.
13
2. araradioaqtiuri moniSvna haptenebiT (mag.,
biotini, digoqsigenini, fluoresceini,
rodamini) fluoresceini (mwvane), rodamini
(wiTeli), DAPI 46-diamidino-2-fenilinindoli
(lurji)
14
upiratesobani    zondis stabiluroba.    usafrT
xoeba.    swrafi gamovlena.    mravlobiTi
erTdrouli moniSvna.    signalis
amplifikacia.    SedarebiT dabali
fasi.    maRali garCevisunarianoba.    imunohist
oqimiasTan erTad gamoyeneba. uaryofiTi mxareebi
   hibridizaciis efeqturobis Semcireba.    daba
li mgrZnobeloba.
15
4. amplificirebuli produqtis gamovlena _
vizualizacia hibridizaciis Semdeg miRebuli
hibriduli nukleinis mJavebis gamovlenis gza
damokidebulia gamoyenebuli zondebis moniSvnis
meTodze, anu arsebobs radioaqti-uri da
araradioaqtiuri vizualizaciis sistemebi.
araradioaqtiuri sistemebi ufro usafrTxo da
swrafia, radioaqtiuri sistemebi ki ufro
mgrZnobiarea.
DAPI-iT moniSnuli qromosomebis kariotipireba
16
fluorescenciis Sefaseba gamosaxulebis analizis
kompiuteruli sistemiT
B-CLL. interfazuli FISH 4-alfa-satelituri
Tanmimdevroba wiTelia, 12-alfa-satelituri
Tanmimdevroba mwvanea.
17
FISH yvelaze farTod gavrcelebulia fluorescentuli
in situ hibridizacia (FISH). FISH pirdapir avlens
dnm-is an rnm-is specifikur regions ujredSi. am
mizniT gamoiyeneba fluoresceiniT moniSnuli
komplementuri zondebi. samizne SeiZleba iyos
qromosomebi, interfa-zuli birTvebi an bioptati.
fluorescentuli signalebi
18
FISH-is upiratesoba da uaryofiTi mxareebi
swrafi da mgrZnobiarea   ujreduli kultura
saWiro ar aris. Sedegebis interpretacia ufro
advilia, vidre kariotipirebis dros.   SesaZloa
kombinacia imunohistoqimiasTan.  iZleva
informacias mxolod gamoyenebuli zondebis Sesaxeb,
sxva aberaciebi ar vlindeba.
19
FISH meTodi metafazur da interfazul ujredebSi.
normalur interfazul ujredSi aRiniSneba 2 mwvane
laqa (BCL-1) da 2 wiTeli laqa (IgH). anomalur
interfazul ujredSi aRiniSneba 3 mwvane da 2
wiTeli laqa, magram unda iyos 1 wiTeli da 1
mwvane laqa.
20
t(1114)(q13q32) translokacia (naCvenebia isriT)
inter-fazul birTvSi, mantiis zonidan
ganviTarebuli limfoma. Bcl-1-is (11q13) zondi
moniSnulia biotiniT da gamovlenilia
avidin-FITC-iT. IgH-is (14q32) zondi moniSnulia
digoqsigeniniT da gamovlenilia misi sawinaaRmdego
rodaminiT.
21

• mikrodeleciis sindromebis diagnostika FISH-iT
• ,,katis knavilis" sindromi (5p.15.2 delecia)
• Miller-Dieker-is sindromi (17p13.3 delecia)
• Smith-Magenis-is sindromi (17p.11.2)
• steroiduli sulfatazas (arilsulfatazas)
• deficiti (X-Tan SeWiduli iqTiozi) (Xp22.32)
• DiGeorge-is sindromi (22q.11)

22
sarZeve jirkvlis karcinoma, HER-2, IHC, FISH
23
TOPA2-is delecia
HER-2-is amplifikacia
24
me-4 qromosomis mikrodelecia, FISH
25
BCR/ABL translokacia, Zvlis tvinis nacxi,
qronikuli mieloleikemia
26
DiGeorge-is sindromi, 22-e qromosomis
mikrodelecia
27
FISH ormagi moniSvniT gamoiyeneba ori moniSnuli
rnm-zondi an rnm zondebis da cilebis
sawinaaRmdego antisxeulebis kombinacia.
gamoiyeneba fluoresceiniT da digoqsige-niniT
moniSnuli rnm. vizualizacia xdeba ori feris
safuZvelze, mgrZnobeloba maRalia.
embrioni ormagi moniSvniT fluoresceini (mwvane)
da digoqsigenini (wiTeli)
28
xuTferiani FISH
29
eqvsferiani FISH
30
qromogenuli in situ hibridizacia
(CISH) dReisaTvis TandaTan ufro farTod
gamoiyeneba SedarebiT axali qromogenuli
vizualizaciis sistema. am dros zondebis moniSvna
xdeba biotiniT, substrati diaminobenzidini an
tute fosfataza, anu igive, rac imunohistoqimiis
dros.
me-17 qromosomis specifikuri alfa-satelituri
Tanmimdevroba
31
nazofaringeuli karcinoma, EBV, CISH
32
EGFR-is amplifikacia kisris regionis rbili
qsovilis simsivneSi, CISH
33

• SedarebiTi genomuri hibridizacia
• (Comparative Genomic Hybridisation CGH)
• upiratesoba da uaryofiTi mxareebi
• mTeli genomis analizi erT gamokvlevaSi.
• saWiro ar aris metafazuri ujredebi.
• SesaZlebelia mcire raodenobiT ujredebis da
  dnm-is (200-500 ng) gamoyeneba.
• SeiZleba arqivis masalis gamokvlevac.

34
CGH avlens amplifikaciis da deleciis yvela
regions genomSi. CGH-is dros moniSnuli
qromosomebis kariotipis gansazRvra xdeba mwvane
da wiTeli fluorescenciis safuZvelze. Sefaseba
xdeba gamosaxulebis analizis sistemiT.
amplifikaciis dros Warbobs mwvane, deleciis dros
wiTeli.
35
CGHsky
36
In situ hibridizaciis gamoyeneba   1. virusuli
infeqciebis gamovlena. 2. genis Tanmimdevrobis
gansazRvra qromosomaSi. 3. genis eqspresiis
lokalizaciis gansazRvra _ gansakuTrebiT
mniSvnelovania paTologiur procesSi ama Tu im
genis rolis gamovlenisaTvis. 4. transkripciis
qsoviluri ganawilebis analizi. 5. specifikuri
m-rnm-is sinTezis cvlilebaTa gamovlena.
37
In situ hiridizaciis upiratesobani 1. genis
zusti anatomiuri lokalizaciis gansazRvra da
maRali mgrZnobeloba. 2. formalinSi
dafiqsirebuli, parafinSi Cayalibe-buli masalis
(maT Soris, arqivis masalis) gamoyeneba. 3.
gamoiyeneba sxvadasxva vizualizaciis sistema, rac
iZleva nukleinis mJavebis erTdrouli gamovlenis
saSualebas. 4. misi kombinacia SesaZlebelia
imunohistoqimiasTan, ris Sedegadac erTdroulad
vlindeba sinTezirebuli cilovani produqti da
Sesabamisi m-rnm an dnm da Sesabamisi ujredebis
fenotipi.
38
5. am meTodiT konkretuli m-rnm-is gamovlena
asaxavs genis transkripciis da m-rnm-is cvlis
inten-sivobas, radgan m-rnm-is done ar aris
damokidebuli peptidis transportze, sekreciaze
da/an daSlaze. 6. In situ dnm-is gamovlenis
upiratesoba isaa, rom SesaZlebelia qromosomebis
fizikuri rukis Sedgena, qromosomebis struqturis
analizi, dnm Tanmimdevro-bebis SefardebiTi
ganawilebis gansazRvra mitozis da meiozis dros,
anomaluri dnm-is struqturis gansazRvra paTologiis
dros. 7. In situ rnm-is gamovlenis upiratesoba
isaa, rom SesaZlebelia genebis SefardebiTi da
droebiTi eqspresiis gansazRvra.
39
In situ hibridizaciis mgrZnobeloba In situ
hibridizaciis mgrZnobeloba damokidebulia
vizualizaciis sistemis mgrZnobelobaze,
hibridizaciis pirobebis optimumze da
araspecifikuri fonis xarisxze. meTodis
mgrZnobelobas gansazRvravs is faqti, rom erT
konkretul ujredSi unda iyos m-rnm-is an dnm-is
10-20 asli mainc. am problemis mosaxsnelad
SeiZleba misi kombinacia PCR-Tan, gansakuTrebiT,
virusuli dnm-is gamovlenisas.
40
In situ hibridizacia / RT-PCR
ISH RT-PCR mgrZnobeloba maRali Zalian
maRali raodenobrivi Sefaseba saSualo 100 infor
macia struqturis Sesaxeb ki ara sakvlevi
obieqtis raodenoba dabali, saSualo,
maRali Zalian maRali kvlevisaTvis saWiro
dro dReebi, kvirebi 30 wT, 2 sT,
dReebi fasi saSualo maRali
41
ISH-Tvis saWiro instrumentebi
42
(No Transcript)