Cromatografa de Afinidad

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Cromatografía de Afinidad

• Principio se basa en la interacción específica
  entre dos moléculas (Ag-Ac, Enz-Sustrato,
  Lectina-HC, Metal-aa). Una de las moléculas, el
  ligando, se inmoviliza en la resina.

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• Factores que influyen en inmunoafinidad
• Riqueza inicial del antígeno en el medio
• Constante de afinidad del Ac (gt 106 M) utilizado
  como ligando
• Facilidad de elución del Ag (dependerá del tipo
  de interacciones que exista entre Ag/Ac)

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• La purificación por inmunoafinidad se puede
  dividir en 3 pasos
• Preparación de la columna de inmunoafinidad
• Activación de la matriz
• Pegado de la proteína en forma covalente
• Bloque de sitios libres
• Unión específica del Ag al Ac de la matriz
  (ligando-ligante)
• Elución del Ag (ligante)

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• Matrices
• No deben impedir el flujo de la proteína a
  purificar
• Deben ser estable a pH extremos y altas cc
  salinas
• Ej Sepharosa 4B (la más simple), Sepharosa CL
  (cross-linked, mayor resistencia), Sepharosa Fast
  Flow, Sepharosa High Performance (menor tamaño de
  partícula). Todas de Pharmacia.

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RESINAS ACTIVADAS Sepharosa 4B-CNBr para
ligandos con grupos amino libres Sepharosa 4B
EAH/ECH con espaciadores de 10/9 C para unir por
los grupos amino o carboxilos Epoxy-activated
Sepharose 6B espaciador hidrofílico prolongado
para unir a traves de grupos OH, NH2 o SH. Los
brazos espaciadores evitan los inconvenientes
estéricos que podrían ocurrir si el ligando
estuviera unido directamente a la matriz.
R-NH2
NH-R
BrCN
C N
O-CNH2
Isourea
Sepharosa 4B
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Ligando Afinidad (Ka) por la sustancia a
purificar debe encontrarse dentro de los rangos
104 - 108 M-1 Si es menor de 104 se desorberá
de la matriz en forma inespecífica, si es mayor
de 108 será muy difícil desorberla.
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• Elección del ligante, ej. Anticuerpos
• Ac policlonal purificado por inmunoafinidad
• Difícil de eluir, pegan con alta avidez
• Se utilizan cuando se generan a partir de
  péptidos sintéticos o contra zonas específicas de
  una proteina.
• Ac monoclonales
• Reactivos ilimitados. Puedo elegir usar Ac de
  alta afinidad.
• Pool de Ac monoclonales (ideal!)

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Ligantes Grupo-Específico Aquellos grupos de
adsorventes que tienen afinidad por un grupo de
sustancias relacionadas, más que por una
sustancia en especial. Proteina A(estafilococo)
región Fc de IgG y moléculas relacionadas con
distinta afinidad Proteína G (estreptococo)
Similar a la proteína A, pero con afinidades
diferentes. IMAC (Immobilized Ion Affinity
Chromat)SephHP ligada covalentemente a un
quelante de cationes divalentes (ácido
iminodiacetico) que puede ser Ni, Zn, Cd, Fe,
etc. Para purificar proteinas recombinantes
modificadas con colas de aminoácidos (Ej Ni
histidina).
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VENTAJAS No hay restricción por volúmen Paso
concentrador (si se usa columna) Especificidad Pur
eza del producto final DESVENTAJAS Precio
(alto) Condiciones de elución drásticas Ligando
específico no disponible o inadecuado
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Preparación de la columna de inmunoafinidad

• Existen tres formas de pegar el Ac a la matriz
• Matrices con proteína A/G reactivo
  entrecruzante
• Los Ac quedan alineados por el Fc
• El reactivo entrecruzante más usado es el DMP
• Matrices activadas
• Utiliza reactivos bifuncionales (ej
  glutaraldehido, bromuro de cianógeno) para
  activar la matriz.
• La reacción entre matriz activada y Ac se realiza
  a pH alcalino (si une por parte proteica)
• Anticuerpo activados (ej puede unirse por los
  HdeC Affi-Gel Hz Hydrazide, une los HdeC de la Ig
  previamente oxidados)

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Cromatografía de Afinidad

• Union del Ag a la columna de inmunoafinidad
• La cinética de la interacción Ag/Ac-matriz es
  distinta a la de la reacción en solución
• Se tarda mas tiempo en llegar al equilibrio.
• Existen 2 metodologías
• En batch
• En columna

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Elución en Inmunoafinidad
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Inmunoafinidad

• Corrida representativa

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Control de la purificación

• Pureza
• SDS-PAGE
• cuantificación
• Bradford, Lowry, Abs 280 (Ac puro)
• SDS-PAGE ST cc (Ac impuro, estimado)
• Actividad Ac
• Comparar resultados del Ac antes y después de
  purificar, normalizando con la concentración de
  Ac.

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Purificación desde sn. cultivo