Toxicidad de Efavirenz y Lopinavirr sobre los adipocitos

1
Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los
adipocitos
Pere Domingo Unidad de Enfermedades
Infecciosas Hospital de la Santa creu i Sant
Pau Universitat Autònoma de Barcelona Barcelona pd
omingo_at_santpau.cat
2
Contenido

• Implicaciones,consecuencias y visibilidad de la
  lipoatrofia
• Fármacos y lipoatrofia (EFV vs. LPV/r)
• Mecanismos patogénicos en la lipoatrofia
• El papel de la mitocondria
• EFV, LPV/r y adipocitos in vitro
• EFV, LPV/r y adipocitos ex vivo

3
Implicaciones de la lipoatrofia

• Calidad de vida
• Efectos psicológicos
• Baja autoestima
• Disminución de la autoconfianza
• Ansiedad y depresión
• Efectos sociales
• Daño en la calidad de la relaciones sociales
• Alienación social
• Dificultad para encontrar ropa adecuada
• Efectos físicos (ej, dolor al sentarse)
• Disfunción sexual
• Descenso de la adherencia

3
ODonovan CA et al, 7th IWADRL Nov 2005, Dublin,
34 James J et al, Dermatol Surg 2002
28979-986Santos CP et al, AIDS
200519(S4)S14-S21 Reynolds NR et al, AIDS Care
Oct 2006 18(7)663-73
4
La lipoatrofia se hace clínicamente evidente
después de perder el 40-50 de la grasa en la
extremides
Estudios en VIH,Controles sanos voluntarios
Adultos VIH, Lipoatrofia clinicamente evidente
al comienzo
10
9.11
9
8
7.22
7.11
7
6
Grasa en las extremidades (kg)
5
3.66
4
2.68
3
2
1
0
Todos los estudios, principalmente hombres
Mujer
Hombre
Hombre
Todos los estudios utilizaron DEXA para medir la
grasa. 1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr.
19996911621169 2. Carr A et al. AIDS.
199812F51F58 3. Moyle G et al. CROI 2005.
Abstract 44LB 4. McComsey GA et al, Clin Infect
Dis. 200438263270 5. Martin A et al. AIDS.
20041810291036 6. Milinkovic A et al.
Antivir Ther. 200712407415 7. Carr A et al.
Lancet. 2004363429438 8. Slama L. Antivir
Ther. 2007,in press.
4
5
Importancia del diagnóstico temprano La
lipoatrofia es difícil de revertir
Mínima ganancia en la grasa en las extremidades
48 semanas después del cambio de los NRTI
9
8.1
8
7
6
Limb fat (kg)
5
3.41
4
2.95
3
2
1
0
Normal 1
Pacientes lipoatróficos al comienzo 2
Pacientes tras el cambio de análogos 2

• Otros estudios dieron resultados similares

5
1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr.
19996911621169 2. Moyle GJ et al. AIDS.
20062020432050 3. Carr A et al. AIDS.
199812F51F58.
6
ACTG 5142 Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre
la grasa periférica LPV/r lt EFV
ACTG 5142 Grasa en las extremidades
P Value
18
20
15
.013
9.8
lt.001
10
5
.007
Cambio de la mediana desde la basal
1.4
0
EFV
-5
LPV/r
-10
LPV/r EFV
-15
Weeks
48
96
0
EFV 188 171 LPV/r 191 166 LPV/r EFV 197 173
Haubrich R et al. 14th CROI 2007 Los Angeles.
Abstract 38.
7
ACTG 5142 La prevalencia de lipoatrofia fue
menor con Kaletra que con EFV
Evolución de la lipoatrofia (gt 20 de pérdida de
grasa en las extremidades)
Valores de P a 96s LPV/EFV vs LPV
0,023 LPV/EFV vs EFV lt0,001 LPV vs EFV
0,003
EFV 188 171 LPV/r 191
166 LPV/r EFV 197 173
Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 123(9)1109-18 .
8
ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue
menor con LPV/r que con EFV independientemente de
los análogos utilizados
Porcentaje de pacientes con lipoatrofia por
subgrupos, semana 96
51n41
40n63
33n43
16n73
12n67
6n50
Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 123(9)1109-18 .
9
ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue
menor con LPV/r que con EFV independientemente de
la definición de lipoatrofia elegida
40
32
28
pacientes
20
17
13
10
4
p0,0027
p0,0004
p0,0016
p0,0008
Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 123(9)1109-18 .
10
Estudio transversal alemán. Resultados
Características de los pacientes

• El 45 estabán tomando TDF, 28 AZT/3TC y 12
  ABC/3TC
• Alta concordancia entre las opiniones de los
  pacientes y de los médicos

Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009
CDB111
11
Estudio transversal alemán. El porcentaje de
pacientes que reportan haber pérdido grasa en las
piernas fue menor con Kaletra que con EFV
p lt 0,05
pacientes que reportan pérdida de gras en las
piernas

• El 79 de los pacientes tratados con Kaletra no
  reportó signos de pérdida de grasa en las piernas
  frente a sólo 68 entre los tratados con EFV.

Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009
CDB111
12
Estudio transversal alemán. Este resultado se
repitió en los tratados con AZT/3TC
p lt 0,05
pacientes que reportan pérdida de gras en las
piernas
Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009
CDB111
13
Estudio transversal alemán. Entre los tratados
con TDF/3TC o FTC también hubo menos pacientes
que notaron pérdida de grasa en las piernas en el
grupo de Kaletra que en el de EFV
p lt 0,05
pacientes que reportan pérdida de gras en las
piernas
Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009
CDB111
14
Causas de la lipoatrofia
Virus VIH
Paciente Genética/Ambiente
HAART
Lipoatrofia
14
15
Mecanismos fisiopatológicos de la lipodistrofia a
nivel celular

• Disfunción mitocondrial
• Proliferación mitocondrial y morfología alterada2
• Ciclo celular y diferenciación adipocitaria
  alterada
• Descenso del tamaño de los adipocitos1-3
• Apoptosis aumentada4
• Sustitución de los adipocitos por tejido
  fibrosos3
• Mediadores proinflamatorios
• Infiltración de macrófagos2,3
• Expresión de IL-6 y TNF -? aumentada3

• Bastard JP, et al. Lancet 2002 359 1028-31
• Nolan D, et al. AIDS 2003 17 121-3
• Jan V, et al. Antivir Ther 2004 9 555-64
• Domingo P, et al. AIDS 1999 13 2261-7

16
Investigación para esclarecer el papel de Kaletra
en la lipoatrofia
Adipocito
T. Adiposo
Individuo
Mitocondria

• Dr. Esplugues

Dr. A. Carr Dr. Domingo

• Dr. Domingo

• Estudio 613
• ACTG 5142
• Dr. van Lunzen

17
Estructura mitocondrial

• AND mitocondrial (mtDNA)
• 16 kb, 2-10 copias/mitocondria en la matriz
• La replicación está controlada por genes
  mitocondriales
• La DNA polymerasa-? mitocondrial es la enzima
  requerida para la replicación del mtDNA
• La inhibición de la mtDNA polymerasa-? conduce a
  la depleción del mtDNA
• Transcripción proteínas mitocondriales
• Polimerasa del RNA (mtRNA) y factores de
  transcripción
• La apoptosis es parte del proceso natural celular
  y se incrementa durante la disfunción
  mitocondrial
• En el contexto de la disfunción mitocondrial
• Se incrementa la apoptosis celular
• Puede aparecer hiperlactatemia

17
Chan DC, Cell June 2006 12571241-1252 McBride
HM, Current Biology July 200616R551-R560
18
Toxicida inducida por los análogos Inhibición
de la mtDNA Polymerasa-?
Los ensayos enzimáticos con NRTIs demuestran la
inhibición de la mtDNA polymerasa-? 1,2
zalcitabina (ddC) gt didanosina (ddI) gt stavudina
gt zidovudina (ZDV) gt lamivudina abacavir
tenofovir

• Resultados
• El grado de inhibición de la DNA polymerase-?
  inhibition varia con los NRTI

• Metodos2
• Células humanas tratadas con NRTIs
• Southern blot para cuantificar mtDNA

• Algunos NRTIs inhiben la mtDNA polymerasa-?

18
1. Kakuda TN. Clin Ther. 200022(6)685708 2.
Birkus G et al. Antimicrob Agents Chemother.
200246716723.
19
Disfunción mitocondrial y apoptosis
Depleción DNAmt, ...
Disfunción cadena respiratoria
20
Disfunción mitocondrial

• Consecuencias potenciales de la disfunción
  mitocondrial Disfunciones celulares
• - DNA polymerase-g1-3
• - Desacopladoras1-3
• - Transportadoras3
• - Stress Oxidativo1-4
• - Apoptosis2,3
• - Fosforilación2,3
• - Procesamiento proteolítico3
• Glicosilación3
• Complicaciones agudas
• Neuropatia1-3
• Esteatosis hepática1-3
• Miopatía1-3
• Pancreatitis1-3
• Acidosis Láctica1-3
• Complicaciones a largo plazo
• Lipodystrophy1-4

Hypoxia Privación de glucosa Inhibidores
metabólicos
Glucose
Fatty acids
LDH
Lactate
Pyruvate
NADH
NAD
CPT-1
Malonyl CoA
PDH
ADP/ATP
?-oxidation
AK
translocator
ATP
NAD
NADH
Acetyl CoA
ATP
AAC
IV
Cito c
NADH
Electron transport chain
III
Krebs cycle
CoQ
II
NAD
?-KDH
NAD
I
NADH
Mitochondrion matrix
NADH
H
Inner membrane
AMPk
Inner membrane space
Outer membrane
Cellular cytosol
Stress metabólico
Adapted from Kakuda TN. Clin Ther 2000 22
685-708 Dobrzyn P, et al. PNAS 2004 101
6409-14 Dagan T. Mitochondrion. 20021397412
2. Day L et al. Mitochondrion. 2004495109 3.
Gerschenson M. Mitochondrion. 20044(5-6)763777
4. McComsey GA. J Acquir Immune Defic Syndr.
2003344549.
21
Inhibición aguda de la respiración mitocondrial
por EFV
(µM)
100
Data not shown
Efects of EFV (?M) on respiration rate

Plt 0.01 Plt 0.001




of control
of control
?M
5 10 15 25
50 100
Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 984
22
La inhibición de la función mitocondrial resulta
en una reducción dosis dependiente del ATP
intracelular
Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 984
23
Adipocyte differentiation a highly regulated
process
TNF-a
TNF-a
Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998
78(3)783-809
24
Mechanisms of NRTI-Induced Mitochondrial Toxicity
PPAR-? gene expression relative to ACTB
housekeeping gene at baseline and at 2
weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in
adipocytes COX-1 gene expression
relative to ACTB housekeeping gene at 6 weeks of
ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in monocytes

• 20 HIV- volunteers received dual NRTI therapy for
  6 weeks (ZDV/3TC or d4T/3TC )
• In the absence of mtDNA depletion, thymidine
  analogue NRTIs down-regulate
• Adipocyte differentiation factors (nuclear
  transcription factor PPAR-?)
• Transcription of mitochondrial chain respiratory
  subunits (COX-1, Cox-2, and Cyt b)
• Negative regulatory effects impede adipogenesis
  and respiratory chain complexes (eg. Complex IV
  via COX1 inhibition)
• NRTI effects on peripheral mononuclear blood
  cells suggest a possible role in other tissues

0.06
0.05
0.04
P 0.003
PPAR-? ACTB
0.03
0.02
0.01
0.0
Baseline
Week 2
1.8
1.6
1.4
1.2
COX1 ACTB
P 0.005
1
P 0.01
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Baseline
Week 6
Week 12
Follow up
Median 66 weeks
24
Mallon PW et al. J Infect Dis. 200519116861696.
25
Effect of EFV and LPV/r on differentiating
adipocytes
Effect of EFV and LPV/r on mature adipocytes
Control (No drug)
Control (No drug)
EFAVIRENZ
EFAVIRENZ
20 µM
2 µM
4 µM
0.5 µM
4 µM
10 µM
2 µM
Massive cell death - no image available
KALETRA
KALETRA
4 µM
10 µM
2 µM
4 µM
2 µM
20 µM
0.5 µM
Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008
P-01
26
Effect of EFV and LPV/r on gene expression
Adipogenesis (PPAR?)
1.2

1

0.8


Log mtDNA copy number

0.6


0.4
0.2
0
2
Control
10
0.5
4
0.5
4
20
40
EFV (µmol/l)
LPV/r (µmol/l)
Plt0.05, Plt0.01, Plt 0.001 vs. control, EFV
vs. LPV/r
Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008
P-01
27
EFV increases pro-inflammatory cytokines and
reduces adiponectin c/w LPV/r in human adipose
cells

• EFV
• 4 µM - increase in levels of MCP-1 (5.3-fold),
  IL-5 (4.2-fold), IL-8 (18.7-fold), PAI-1
  (5.7-fold) and HGF (5.5-fold)
• Significant reduction of adiponectin and leptin
  (17 and 19 of levels vs controls respectively)
• LPV/r
• No induction of MCP-1, IL-8 and PAI-I
• Minor but significant reduction in release of
  adiponectin and leptin (71 and 76 of levels vs
  controls, respectively)
• HGF and IL-6 were induced to a similar extent in
  response to LPV/r and to EFV
• mRNA
• Adiponectin mRNA significantly decreased with
  EFV 2 µM and LPV/r 4 µM (EFV inhibition of
  mRNA significantly worse).
• Leptin mRNA significantly decreased with EFV 2
  µM and LPV/r 10 µM
• Conclusions
• In human adipocytes in culture, EFV causes a
  higher release of pro-inflammatory cytokines and
  a more profound impairment in the release of
  adiponectin compared to LPV/r.

Domingo P et al, 5th IAS 2009, TUPEB167
28
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
Adiponectina
MCP-1
29
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
PPARg
8
9
P NS
7
P NS
8
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
1
2
0
1
-1
0
-2
Naive
TRUEFV
Naive
TRUKAL
TNFa
P NS
30
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
Cyt B
ADNmt
31
HIV Infection Contributes to Lipodystrophy
Through Alteration of Gene Expression in Adipose
Tissue

• Compared to HIV-negative controls, ARV-naïve
  HIV-positive patients had significant
• Decreases in mRNA of COX-2, COX-4, UCP2, C/EBP-a,
  PPAR-?, GLUT4, LPL, leptin, and adiponectin
• Increases in PGC-1a, TNFa, and ?-2 microglobulin

PPAR-? mRNA/18SrRNA (x10-4)
TNF-a mRNA/18SrRNA (x10-6)
COX-2 mRNA/18SrRNA (x10-2)
P0.027
P0.023
P0.046
P0.001
P0.001
Control
Naïve
LD
Non-LD
Giralt M et al. Antivir Ther. 200611729740.
32
ACTG 5142 Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre
la grasa periférica LPV/r lt EFV
ACTG 5142 Grasa en las extremidades
P Value
18
20
15
.013
9.8
lt.001
10
5
.007
Cambio de la mediana desde la basal
1.4
0
EFV
-5
LPV/r
-10
LPV/r EFV
-15
Weeks
48
96
0
EFV 188 171 LPV/r 191 166 LPV/r EFV 197 173
Haubrich R et al. 14th CROI 2007 Los Angeles.
Abstract 38.
33
La toxicidad grasa es bifásica
Grasa subcutánea
TARc
Tiempo
34
Conclusiones

• Tres factores implicados en la LD
• Virus
• Huésped
• Fármacos
• La patogenia de la lipodistrofia es
  multifactorial
• Mitocondria
• Diferenciación
• Inflamación
• EFV es más tóxico que LPV/r in vitro.
• A 48 semanas dicha toxicidad no es apreciable ex
  vivo.
• El curso de la LD es bifásico

35
Agradecimientos
Biologia U.B. Francesc Villarroya Marta
Giralt Joan C. Domingo Julieta Díaz

• Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
• Mª del Mar Gutierrez
• Mª Gracia Mateo
• Mª Antonia Sambeat
• Angels Fontanet
• Jessica Muñoz
• Jessica Martínez

36
(No Transcript)