II Curso Internacional de Actualizaciones en Gastroenterolog

1
II Curso Internacional de Actualizaciones en
Gastroenterología
Biología molecular, un puente entre la genética
molecular y la clínica
Carlos Sanguinetti
2
Las tecnologías moleculares nos permiten observar

• El genotipo del paciente
• La existencia de un agente infeccioso
• El genotipo del agente infeccioso
• La interacción entre ellos

3
Las tecnologías moleculares nos permiten observar

• El genotipo del paciente
• La existencia de un agente infeccioso
• El genotipo del agente infeccioso
• La interacción entre ellos

4
Genotipos

• Causales
• Patologías monogénicas
• HH, fibrosis quística, hipercolesterolemia
  familiar, BRCA.....
• Predisponentes
• Patologías multigénicas, multifactoriales, suma
  de efectos, modulación por el ambiente
• APC, E Celíaca, Obesidad, diabetes, E
  Cardiovascular
• Confundidores
• O desconocemos o se compartan como resistentes a
  algunas patologías y predisponentes a otras
  (APOE)

5
Aplicaciones de la Medicina Molecular

• Identificación de la etiología genética
• Genes relacionados a enfermedades
• Estudio de la patogenia
• mecanismos que permiten que el genotipo se
  traduzca en un fenotipo
• Diagnóstico prenatal, pre-mórbido y mórbido
• Diagnóstico, Identificación y seguimiento de
  agentes infecciosos
• HCV, HBV, H. Pylori, diagnóstico, seguimiento,
  genotipado
• Producción de nuevos agentes terapéuticos
• Proteínas recombinantes
• Terapia génica
• Patologías monogénicas
• Desarrollo de la farmacogenética
• Resistencia, metabolización de drogas
• Prevención

6
Los factores genéticos

• Virtualmente, contribuyen a cualquier enfermedad
  humana confiriendo susceptibilidad o resistencia
  interactuando con factores del ambiente.
• Determinar la contribución genética a la
  enfermedad está cambiando la prevención, el
  diagnóstico y el tratamiento.

7
Porqué

• Cada uno de nosotros somos diferentes.
• No nos afectan las mismas enfermedades.
• No respondemos de la misma manera a los fármacos.
• Porque una parte significativa de la respuesta
  está en nuestros genes

8
Impacto del PGH en la medicinala medicina
genómica

• Uso rutinario del análisis genotípico, para
  mejorar la calidad del cuidado de la salud
• Una nueva era en la medicina
• Individualizada
• Predictiva
• Preventiva

9
Algunos conceptos comunes

• La genética es de las enfermedades raras y poco
  frecuentes
• Los genes son inmodificables y la genética es
  inmodificable
• Existen los genes normales y las mutaciones
• Las variaciones comunes no influyen las
  enfermedades comunes
• No participan en la enfermedad crónica. No
  importa si participan porque el tratamiento es el
  mismo.
• No son factores de riesgo relevantes donde hay
  factores modificables.
• Es cara, solo diagnóstica.
• De genética no se nada así que no la uso
• Al paciente Ud vino acá por Ud o por sus
  parientes?

10
Tipo y frecuencia de alteraciones genéticas
Tipo Frecuencia a los 25 años Frecuencia después de los 25 años Toda la vida
Cromosómicos 1.8/1000 2/1000 3.8/1000
Gene único 3.6/1000 16.4/1000 20/1000
Multifactoriales 46.4/1000 600/1000 646.4/1000
Genética somática - 240/1000 240/1000
antes
ahora
Modificado de Rimoin y col. Cap 3Principles and
Practice of Medical Genetics.2002. Ed Churchil
Livingstone
11
la hipótesis central es

• enfermedades raras mutaciones raras
• enfermedades comunes mutaciones comunes

12
Enfermedades hereditarias
13
Contribución de Biología Molecular (genómica) en
gastroenterología
14
Hemocromatosis hereditaria
15
Hemocromatosis hereditaria

• El gene de HFE está localizado en el cromosoma 6
  en 6p21.3 y codifica una proteína de 343 a.a. que
  se asocia a la beta2 microglobulina y se liga al
  receptor de transferrina reduciendo su afinidad
  por la transferrina cargada con hierro entre 5 y
  10 veces.
• La mutación C282Y altera estas asociaciones y su
  presentación en la superficie celular de los
  enterocitos en las criptas duodenales
  perturbando la regulación de la absorción de
  hierro
• El kit HH C282Y analiza un cambio de base de
  guanina por adenina en la posición 845 del gene
  HFE, lo que genera un reemplazo de una cisteína
  por una tirosina en el codón 282 de la proteína.
• El análisis requiere una amplificación por PCR
  de un fragmento del exón 4 del gene HFE. Sobre el
  producto de amplificación se detecta la presencia
  o ausencia de un cambio de base mediante
  digestión con una enzima de restricción (RFLP).

16
Algoritmo
17
HH- PCR RFLP
C282Y
PM HH C282Y Producto de PCR (ADN
control) Producto de PCR luego del corte con la
enzima de restricción de un individuo
heterocigota Banda de 249 pb banda
control Banda de 141 pb banda normal Banda
de 111 pb banda mutada La banda de 390 pb no
debe estar presente si existe una digestión
completa.
1 2 3
390 pb
249 pb
141 pb
106 pb
18
El proceso

• Tubo de hemograma (1ml)
• Extracción de ADN
• PCR
• RFLP
• Electroforesis
• Resultado en 48 horas

19
Una mirada al cáncer colorectal
20
Riesgo de cáncer colorectal
5
Población General
Historia Personal de neoplasia colorectal
1520
Inflammatory bowel disease
1540
7080
Mutaciones de HNPCC
gt95
Poliposis adenomatosa Familiar
Lifetime risk ()
0
20
40
60
80
100
21
Causas de la susceptibilidad al CCR
Esporadicas (6585)
Familiares (1030)
Sindromes raros de CCR (lt0.1)
Coloreactal cáncer familiar no polipósico (HNPCC)
(5)
Poliposis adenomatosa familiar (FAP) (1)
Adapted from Burt RW et al. Prevention and Early
Detection of CRC, 1996
22
Proceso
Mutaciones en P53
Activación de K-ras
Otras alteracioiones
Mutaciones en APC
Delección 18q
Adenoma temprano
Adenoma intermedio
adenoma tardío
Carcinoma
Metástasis
Epitelio Normal
Epitelio hiper proliferativo
Cuál es el primero ?
Adapted from Fearon ER. Cell 61759, 1990
23
Alteraciones comunes en el CCR

• P53 (transversión G-T codón 249) (15 a 50)
• Pérdida de heterocigocidad (LOH 8p-17p)
• Mutaciones en b catenin (20-40)
• Metilación del promotor p16INK4a (70)
• Metilación del promotor E-caderin (70)
• Baja expresión de p27 (50)

24
Genética de la Poliposis adenomatosa familiar

• Herencia autosómica dominante
• Causada por mutaciones en el gen supresor de
  tumores APC en el cromosoma 5q
• Mas del 30 de los pacientes tienen mutaciones
  germinales de novo
• Muchas familias tienen una única mutación
• Muchas mutaciones son proteínas truncadas (stop)
• Emerge la relación genotipo - fenotipo

25
Gen APC

• Chromosome 5 q 21
• 15 exons
• Functions
• Tumor suppressor gene
• Wnt-signaling pathway.
• Mediator of intracellular adhesion
• More than 300 mutations described
• Majority located at 5 end
• 95 are truncating mutations
• Production of short, inactive protein
• Location of APC mutation affects phenotype of FAP.

26
The APC Tumor Suppressor Gene
Codon 1309
5'
3'
27
Tecnología

• Secuenciación de ADN

28
Genética del CCHnP

• Herencia autosómica dominante
• Penetrancia 80
• Genes pertenecientes a la familia DNA mismatch
  repair (MMR)
• Heterogeneidad Genética (MLH1, MSH2, MSH6, PMS1,
  PMS2)

29
Contribución de las Mutaciones en familias HCCnP
Sporadic
Familial
MSH2 30
Unknown 30
HNPCC
Rare CRC syndromes
FAP
MLH1 30
PMS1 (rare)
MSH6 (rare)
Liu B et al. Nat Med 2169, 1996
PMS2 (rare)
30
Riesgo de Cáncer en HNPCC
Aarnio M et al. Int J Cancer 64430, 1995
100
con cáncer
Colorectal 78
80
60
Endometrial 43
40
Stomach 19
Biliary tract 18
20
Urinary tract 10
Ovarian 9
0
20
40
60
80
0
Edad (años)

31
Microsatellite Instability (MSI)

• 1015 de los tumores esporádicos tienen MSI
• 95 de los HCCnP tienen MSI en múltiples loci
• El análisis es simple y rutinario

32
Fibrosis quistica
33
Fibrosis quistica

• Enfermedad genética, autosómica recesiva, causada
  por una mutación en el brazo largo del cromosoma
  7.
• Este gen contiene la información para la
  producción de una proteína reguladora del
  intercambio de electrolítos a través de las
  membrana,
• llamada CFTR,
• su anomalía produce alteraciones en el transporte
  de cloro y sodio en los órganos cubiertos por
  tejido epitelial.
• afecta diferentes órganos y sistemas, en especial
  el aparato respiratorio, el páncreas, las
  glándulas sudoríparas y el sistema reproductor
  masculino.
• crónica y de evolución progresiva.
  

34
Criterios Diagnósticos de FQ

• Sospecha
• una o más de las características clínicas de la
  enfermedad
• historia de hermanos con FQ
• Investigación neonatal positiva
• Confirmación
• dos test de sudor positivos
• dos mutaciones del gen FQ conocidas
• diferencia de potencial de membrana nasal anormal
• Sociedad Argentina Pediatría, Consenso de
  Fibrosis Quística, 1999

35
Evidencian la anormalidad del CFTR

• Prueba del Sudor
• Biología Molecular
• En una población de 220 pacientes, la mutación
  ?F508 se encontró en 58 de los cromosomas FQ
  sobre un total de 39 mutaciones que representaron
  el 83 de todos los alelos mutados estudiados
• Potencial de Membrana Nasal

36
Múltiples mutaciones conocidas en un gen
Fibrosis quistica
37
CFTR gene

• Discovery of the
• 1989 by Francis Collins and Lap-Chee
  TsuiChromosome 7 Locus 7q31.2
• What Causes CF?
• Caused by a mutation in the gene that produces
  the protein responsible for moving the chloride
  ions through the cell membranes
• Mutations
• Most common is the deletion of the phenyalanine
  (?F508)
• Deletion of three consecutive base pairs in the
  ATP-binding, nucleotide-binding fold (NBF), cause
  of defective folding of CFTR in the endoplasmic
  reticulum which prevent it from moving
  efficiently through the Golgi apparatus

38
Las tecnologías moleculares nos permiten observar

• El genotipo del paciente
• La existencia de un agente infeccioso
• El genotipo del agente infeccioso
• La interacción entre ellos

39
Un ejemplo Virus de la Hepatitis C (VHC)

• Identificado por Choo et al. en 1989
• 170 millones de personas infectadas
• Infecta hepatocitos y células mononucleares
• 80 cronicidad, 20 cirrosis hepática y 4
  carcinoma
• Huésped natural humano
• Transmisión parenteral y sexual
• Cansancio, malestar, anorexia.
• Replicación viral, lesión hepática, transplante

40
Diagnóstico
anti HCV (EIA 3)
Sensibilidad y especificidad 95
Falsos negativos inmunosuprimidos
anti HCV (RIBA 3)
Prueba suplementaria
Costosa y utilidad escasa
HCV RNA (PCR)
Confirma infección
Sensibilidad y especificidad gt95
Gretch DR. Hepatology 199726(Suppl 1)43S-47S.
AAEEH. Consenso HCV, 2000
41
Diagnóstico
Síntomas
anti-HCV
título
HCV RNA
ALT
Normal
6
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
años
meses
42
Procedimiento molecular
Plasma o suero
ARN total
ADN copia
PCR
Transcripción Reversa
Contaminación Control interno Positivo
Electroforesis
43
HCV Cualitativo por RT PCR

• Real Time PCR
• Método usado para medir la presencia o cantidad
  de ácido nucleico por la Reacción en Cadena de la
  Polimerasa (PCR).

44
HCV Cuantitativo por RT PCR
45
Tratamiento Criterios de Respuesta
Basal
Tratamiento
No Respondedor
HCV RNA
Recidiva intratratamiento
Respondedor con Recidiva
Respuesta Sostenida
HCV RNA ND
Sem 12
Tiempo
Respuesta histológica disminución de 2 puntos de
la actividad inflamatoria y/o de 1 punto de la
fibrosis.
46
Determinación de Genotipos
PCR
Genotipificación
Secuenciación
RFLPs