EFECTOS DEL SOLVENTE

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EFECTOS DEL SOLVENTE
Como la fluorescencia no es un fenómeno
instantáneo luego de la absorción, ésto le da
tiempo al solvente que rodea al fluoróforo para
reorganizarse, estabilizando al estado
excitado. El grado de estabilización depende
del momento dipolar de dicho estado y de la
polaridad del solvente (efecto general del
solvente) Aparte el solvente puede presentar
interacciones específicas con el estados
excitado. Si hay más de un estado posible, dichas
interacciones puede cambiar la estabilidad
relativa de los EE y puede haber cambios muy
dramáticos en el espectro (efectos específicos
del solvente) Asimismo, si el tiempo de vida
está es el orden del tiempo de relajación del
solvente, al hacer medidas resueltas en el tiempo
se puede estudiar la cinética de la relajación
del solvente.
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Un ejemplo
DOS (t-4-dimetilamino-4-(1-oxibutil)estilbeno)
en distintos solventes y en membranas de DPPC
(linea punteada)
gt polaridad
CH ciclohexano T tolueno AE acetato de
etilo Bu butanol
A medida que baja la polaridad del solvente el
espectro se mueve al azul. Es una observación
bastante general. En ciclohexano el espectro es
cualitativamente distinto (efecto específico de
solvente) La DPPC tiene una polaridad similar
al AE
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Típicamente ?E gt ?G. Luego de la excitación los
dipolos del solvente se reorientan, estabilizando
S1. Los fluoróforos que no tienen momento dipolar
presentan efectos de solvente mucho más acotados
(ej. hidrocarburos saturados)
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El espectro de absorción es mucho menos
sensible al solvente, porque la escala del
proceso es mucho más rápida como para que haya un
reordenamiento.
Cual es la utilidad de todo esto?
Que en muchos casos el espectro de emisión nos
dá infomación acerca del entorno del
fluoróforo. Por ejemplo en una
desnaturalización de un proteína los Trp cambian
de entorno y generalmente se observa un cambio
espectral. O cuando se supera la CMC de un
lípido se puede ver la inserción de una sonda.
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Funciona bien para solventes no próticos Es
independiente de las características particulares
del solvente, i.e.cualquier svte con los mismos
parámetros daría el mismo corrimiento. No toma
en cuenta interacciones específicas, como puentes
hidrógeno o salinos.
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Por ejemplo El indol en ciclohexano presenta
un espectro altamente estructurado, pero pequeños
agregados de EtOH (1-5 ) cambia mucho las cosas.
Esto es por un efecto específico que cambia el
orden de estabilidad de los estados excitados
(hay dos). Se forma un puente hidrógeno con el
grupo imino del indol El corrimiento ulterior
sí se debe a un efecto general de solvente
(aumenta la polaridad y se corre al rojo)
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Un aumento de n baja la diferencia de energía
(pues disminuye ?A) , mientras que un aumento de
? la incrementa (pues disminuye ?F). Esto se
debe a que n depende del movimiento de electrones
del solvente, que es un proceso instantáneo y
ocurre durante la absorción. En cambio ? es una
propiedad que depende de movimientos electrónicos
y moleculares, es un proceso más lento que sólo
estabiliza el estado excitado. Un incremento de
n permite que ambos estados se estabilicen
instantáneamente, lo que provoca una disminución
de la diferencia de energía G-E, pues en general
?E gt ?G. Por eso la mayor parte de las moléculas
presentan un corrimiento hacia el rojo en el
espectro de absorción cuando se los lleva de fase
gaseosa a un solvente. La estabilización por
constante dieléctrica implica un reordenamiento
del solvente, y es un proceso que depende del
tiempo (y varía con T y la viscosidad)
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Veamos esto en forma gráfica
La ecuación de Lippert se puede deducir de
forma más o menos sencilla (Lakowicz, capítulo 6)
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Aplicación de la ecuación de Lippert
TNS se corre de 416 nm en acetonitrilo a 500 nm
en agua. Aparte hay cambios drástico en Q ANS
en agua Q 0.002 ANS unida a BSA Q 0.4
Acá la amina sustituída es más sensible que la no
sustituía debido a que tiene un momento dipolar
mayor. Un comportamiento lineal es indicio de que
hay sólo efectos específicos
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En cambio acá claramente hay un quiebre, o que
indica una inversión de estados excitados al
aumentar la polaridad del solvente
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Efectos específicos del solvente por puente
hidrógeno, transferencia de carga, etc
2-anilinonaftaleno en ciclohexano con agregado de
EtOH 1) 0 , 2) 0.2 , 3) 0.4 , 4) 0.7 , 5)
1.7 . Se ve un cambio cualitativo al principio,
con agregado ínfimos de EtOH.
2-acetilantraceno en ciclohexano con agregado de
MetOH 0) 0, 1) 0.03, 2) 0.05, 3) 0.075, 4) 0.12,
5) 0.2, 6) 0.34
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Efectos de la temperatura cuando se baja T o
aumenta la viscosidad el tiempo de relajación del
solvente puede hacerse parecido al tiempo de vida
del estado excitado.
Disminuir la T da un efecto similar al que
daría bajar la polaridad del entorno
PATMAN en propilenglicol
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Cómo daría en estos casos de relajación lenta
del solvente el decaimiento a distintas ??
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En base a esto se puede ver como evoluciona el
espectro en el tiempo
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DANCA unido a apomioglobina noten que en altas
? a tiempos cortos se ve un aumento de F PORQUE?
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Corrimiento del espectro (CM) DANCA-apomioglobina
a medida que baja T la relajación es más lenta
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En la siguiente sección vamos a ver quenching de
fluorescencia. Nos sirve para medir entre otras
cosas el grado de exposición al solvente de un
fluoróforo.