Experimentos de Microarreglos: desde la biolog

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Experimentos de Microarreglos desde la biología
molecular a la estadística

• Diana M. Kelmansky
• Instituto de Cálculo
• FCEN-UBA

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Qué son los microarreglos?

• Microarreglos pequeños soportes sólidos
• sobre los que se inmobilizan ó pegan, miles de
  secuencias de diferentes genes,
• en posiciones fijas ordenadas

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Dos tecnologías
Delivery
Synthesis arrays

chips
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• spotted oligonucleotidos (oligos) son
  espoteados spotted- directamente sobre el
  arreglo
• síntesis directa base por base los
  oligonucleótidos se fabrican in situ utilizando
  métodos tales como fotolitografía (ej.
  Affymetrix chips)
• o síntesis química (ej., ink-jet Agilent)
• ?????????????????????????????????

5
Portaobjeto y cabezal de impresión -
print head
6
http//www.stat.berkeley.edu/sandrine/Docs/Talks/
MBI04/Lects/lect1MarrayTech.pdf
7
Un segmento de un spot de un microarreglo - las
hebras son las moléculas de ADN depositadas -
figura tomada de (Duggan et al., Nature Genetics
21 10-14, 1999)
8
Objetivo Identificar genes expresados
diferencialmente

• Cambios en la abundancia de
• genes expresados mRNA arreglo de
  transcriptomas
• ADN genomico
• entre condiciones diferentes

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Grandes Esperanzas!
Datos
obtenidos en PubMed Schena M,et al. Quantitative
monitoring of gene expression patterns with a
complementary DNA microarray. Science (1995)
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Grandes Esperanzas!

• Mark Schena
• Microarray Analysis Wiley 2003
• Al final de la introducción
• Fifty years from now, and long after human
  disease has been eradicated, we will look back
  incredulously at the start of this millennium and
  wonder how we ever endured cancer, heart disease,
  AIDS and thousands of other illnesses that
  compromise our well-being

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• De qué se trata todo esto?
• Cómo está relacionado con estadística?
• Comencemos

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Expresión de un gen

• Casi todas las células de nuestro cuerpo
  contienen un conjunto completo de cromosomas y
  genes idénticos.
• Sólo una fracción de estos genes están
  encendidos .
• Este subconjunto, que está expresado, le
  confiere propiedades específicas a cada tipo de
  célula.
• "Gene expression . Términos utilizados para
  describir la transcripción de la información
  contenida dentro de los cromosomas en moléculas
  de ARN mensajero.
• Luego estas son traducidas a las proteinas que
  realizan principales funciones de las células

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Adenina Timina Guanina Citosina
14

• ROSALIND FRANKLIN la fotógrafa del ADN
• Francis Crick, James Watson y Maurice Wilkins
• -modelo del ADN 1953-
• en base al
• trabajo de Rosalind Franklin como bióloga
  molecular y cristalógrafa
• Murió de cáncer en 1958 con 37 años
• Premio Nobel de Medicina -1962-

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Transcripción
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Dogma central de la biología molecular

• Doble cadena de ADN
• ? transcripción o
  expresión
• Simple cadena de ARNm
• ?
• ? traducción
• Proteína

Microarreglo ? ? ? ? ? ? ?
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Cómo funciona un microarreglo?

• Utiliza la capacidad de las moléculas de ARNm de
  adherirse específicamente, o hibridar a su cadena
  complementaria de ADN
• cADN probe ...AAAAAGCTAGTCGATGCTAG...
• ARN target ...UUUUUCGAUCAGCUACGAUC...

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(No Transcript)
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Al finalizar el experimento tenemos
two color spotted microarray un microarreglo de
dos colores
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Datos
Imagen superpuesta de un sector de un
Microarreglo con colores artificiales

• Cuáles son los datos en un experimento de
  microarreglos ?
• Archivos tiff de
• las imágenes digitales escaneadas
• Una para cada color
• La intensidad de cada pixel representa la
  abundancia del gen transcripto en el sitio
  correspondiente del arreglo
• Procesamiento de la imagen
• Datos Crudos

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Imperfecciones de los spots
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Redondeamos microarrays de dos canales-

• ARNm tejido patógeno de hígado cADN etiqueta
  fluorescente (label) (Cy5) reverse
• ARNm tejido sano de hígado cADN
  etiqueta fluorescente (label) (Cy3)
  transcription
• Hibridice igual cantidad de mARN para cada
  muestra sobre el microarreglo
• Lave el microarray para eliminar pegado
  inespecífico - unspecific binding.
• Escanee el microarray con longitudes de onda
  diferentes para exitar a cada uno de los tintes
• 2 imágenes digitales, una para el
  fluor Cy3 y la otra para el Cy5
• representan las intensidades
  para cada una de las muestras en el estudio
• ?
  datos crudos pixel por pixel
• Señal de fluorescencia Promedio para cada gen
  nivel de expresión del gen
• otros estadísticos ? ? ? ? ? datos
  iniciales gen por gen

Este experimento tiene muchos errores
sistemáticos y aleatorios
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MA-plot

• Diagrama de dispersión (Scatter plot) de
• M log2 ( Xred / Xgreen )
• log2 ( Xred ) - log2 ( Xgreen )
• versus
• A (log2 ( Xred ) log2 ( Xgreen )) / 2
• Intensidad

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MA plot MXY plot
Experimento SELF-SELF ideal
25
MA plot MXY plot
Experimento SELF-SELF real
sesgo espacial
Sesgo dependiente de la intensidad
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• Objetivo Identificación de genes expresados
  diferencialmente
• Requiere múltiples tests
• con un nivel global razonable
• (false discovery rate)

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos
y análisis de datos de microarrays

• Diseño. El diseño del experimento afecta la
  validez y la eficiencia de los resultados.
• In other contexts, and possibly in these, the
  results have been driven by study inadequacies
  rather than by biology. Beware! (T. Speed 2005)

28
Algunos aspectos estadísticos de los experimentos
y análisis de datos de microarrays

• Preprocesamiento.
• análisis de imágen cuantificación de los
  spots distinguir las intensidades del
  foreground de las del background y los
  artifacts. Medidas resumen.
• normalización - control del sesgo dentro y entre
  microarreglos, transformaciones de los datos.

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos
y análisis de datos de microarrays

• Inferencia. Procedimientos de tests simultáneos
  Multiple testing procedures. Generalmente
  respecto a qué genes están expresados
  diferencialmente.

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos
y análisis de datos de microarrays

• Clustering y discriminación
• (llamados Clasificación por microarray
  biologists).
• Clases (categorías, etiquetas) pueden ser
• muestras ( 1 - cientos)
• o
• genes . (10000 - 40000)

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• Clustering y discriminación - cont
• Clases desconocidas
• clasificación no supervisada
• cluster analysis por los estadísticos,
• unsupervised learning por los computadores
  científicos
• class discovery por biólogos de microarreglos.

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• Clustering y discriminación - cont
• Clases definidas de antemano clasificación
  supervisada - supervised classification sobre
  por lo menos una parte de los datos
• Los objetivos incluyen describir diferencias
  entre clases y/o clasificar observaciones
  fututas. Llamadas clasificación o discriminación
  y class prediction por microarray biologists.
• Los datos para los que las clases son conocidas
  forman el llamado training o learning set,
  aquellos datos cuyas clases no son utilizadas
  pero conocidas forman el test set. También se
  utiliza Allocation para describir la asignación
  de clases a los nuevos datos.
• Estas distinciones no son universales.

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A) Diseño. Consenso 1 La replicación biologica
es indispensable.

• Pueden realizarse dos tipos de replicaciones
• replicación técnica el ARNm de un único caso
  biológico
• es utilizado
  en múltiples microarreglos
• replicaciones biológicas se extrae ARNm de
  diferentes
• 
  sujetos

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• A) Diseño. Consenso 2 Es necesario aumentar la
  potencia mediante el tamaño de la muestra.
• Deben realizarse análisis de potencia
• Aplicando estimaciones específicas para
  experimentos de microarrays
• Más replicaciones proveen mayor potencia.

• No hay concenso respecto de cuales
  procedimientos para hallar el tamaño de la
  muestra son los mejores.

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A) Diseño. Consenso 3 Pooling muestras
biologicas puede ser útil.
La variabilidad entre arreglos puede ser reducida
pooling ARNm de replicaciones biológicas.
Por ejemplo 15 casos divididos en 5 pools de 3,
cada pool corrido en un array por separado
tendrá
más potencia que 5 casos corridos an arreglos
diferentes
menos potencia que cuando los 15 casos son
corridos en arregos diferentes
36
A) Diseño. Consenso 3 Pooling muestras
biologicas puede ser útil. Cont
Sin embargo Pooling ARN de n casos y creando n
replicaciones técnicas no es una estrategia mejor
que hibridizar n arrays a las n muestras
individuales de RNA
Problema potencial el poisoned pool, un
outlier puede arruinar los resultados.
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A) Diseño. Consenso 4 Evite los factores de
confusión - confounding Las mediciones de
Microarrays pueden estar muy influenciadas por
factores externos.
Por ejemplo Si dos tratamientos son aplicados a
dos grupos de pacientes cuando los factores
externos no están totalmente balanceados entre
los grupos esto puede confundir el estudio y
llevar a conclusiones falsas. (Confounding
epidemiología) Los arreglos deberían provenir
de un únco lote y procesados en el mismo día por
el mismo técnico. Analizar la misma cantidad de
muestras de los dos grupos en estudio y
aleatorizar los casos a los niveles de estos
factores (lotes de arreglos, técnicos, día)
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• B) Preprocesamiento
• Análisis de la imagen. Hay diferentes propuestas,
  fundamentalmente en la distinción entre las
  intensidades del forward y el backward
  segmentation.
• Normalization. Diversos procedimientos para
  permitir las comparaciones entre los arreglos.

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• C) Inferencia . Consenso
• Solo fold change M gt k, no es adecuado
• Mi log2(Ri/Gi)
• Utilice un estadístico que incorpore la
  variabilidad
• t
• Use variance shrinkage
• Use métodos de estimación del FDR en las
  comparaciones múltiples

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D) Classificación Consenso 1 La clasificación
no supervisada se utiliza en exceso. Es una de
las primeras técnicas estadísticas utilizadas en
el análisis de microarrays y es una de las
preferidas.
El investigador tiene garantizada la obtención de
un agrupamiento (clustering) de genes, sin
importar

• el tamaño de la muestra,
• la calidad de los datos,
• el diseño del experimento o
• cualquier otra validez biológica que esté
  asociada con el agrupamiento.

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D) Clasificación Consenso 1. Cont.

• Clasificación no supervisada, debería ser
  validada utilizando procedimientos basados en
  re-muestreo (resampling-based procedures).
• Si la clasificación no supervisada es inevitable,
  debería proveerse algún tipo de medida de
  reproducibilidad. Aquellos procedimientos que
  re-muestrean a nivel de caso más que a nivel de
  gen- todos tienen una performance razonable y
  ninguno es considerado el mejor.

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D) Classificación Consenso 2 Los procedimientos
de clasificación supervisada requieren
cross-validación independiente.

• Las reglas de predicción están basadas en una
  cantidad relativamente pequeña de muestras de
  distintos tejidos de tipos conocidos que
  contienen los datos de expresión de muchos
  (posiblemente miles) de genes.
• Problemas posibles
• sobreajuste (overfitting),
• sesgo de selección (selection bias)

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Estudios futuros

• Microarray data analysis from disarray to
  consolidation and consensus
• Allison D, Cui X, Page G, Sabripour M (2006)
  Nature Reviews Genetics Vol 7 Jan
• Sugieren estudiar
• If and how the vast number of genes assayed in
  microarray experiments could be used to partially
  compensate for small sample sizes when using
  resampling-based inference.
• For all statistical procedures, the fact that
  transcripts are not necessarily independent
  (co-regulation) should be considered.

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MÁS ESTADÍSTICA
Semilinear High-Dimensional Model for
Normalization of Microarray Data A Theoretical
Analysis and Partial Consistency (2005) Fan J,
Peng H, Huang T. JASA, vol. 100, no. 471, pp.
781-796. With discussion. All of the
discussants call for more statistical
understanding of various procedures in use. We
agree whole heartedly with this and contribute
the article under discussion in the hope that it
will stimulate more statisticians to work on this
area.
45
Recuerdan?
Cuántos incluyen análisis estadístico?
46
(No Transcript)
47
Algunas referencias
A Model Based Background Adjustement for
Oligonucleotide Expression Arrays. Wu Z, Irizarry
RA, Gentleman R, Martinez Murillo F, Spencer F
(2004) JASA, 99, 909-917. Semilinear
High-Dimensional Model for Normalization of
Microarray Data A Theoretical Analysis and
Partial Consistency (2005) Fan J, Peng H, Huang
T. JASA, vol. 100, no. 471, pp.
781-796 Selection bias in gene extraction on the
basis of microarray gene-expression data.
Ambroise C, McLachlan G (2002) PNAS Prediction
by Supervised Principal Components. Bair E,
Hastie T, Paul D, Tibshirani T (2006) JASA, vol.
101, no. 473, pp. 119-137 Microarray data
analysis from disarray to consolidation and
consensus Allison D, Cui X, Page G, Sabripour M
(2006) Nature Reviews Genetics Vol 7 Jan
48
MUCHAS GRACIAS!