Diferenciacin de las clulas sanguneas a partir de clulas madre de mdula sea

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Diferenciación de las células sanguíneas a partir
de células madre de médula ósea
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Células del sistema inmune
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Poblaciones celulares en sangre entera
Células nucleadas Se producen en medula ósea
(humanos a un ritmo de 80 millones por minuto) Se
pueden reconocer por sus propiedades de tinción
y su estructura interna
Leucocitos
No granulosos

• Linfocito
• Heterogeneidad morfologica, 6-10um.
• Citoplasma basófilo muy escaso.
• Puede tener granulaciones escasas
• Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se
  tiñe de color
• violeta y estructura compacta.

• Monocito
• Citoplasma basófilo.
• Tiene numerosas granulaciones pequeñas y
  distribuidas
• regularmente (no se ven con aumentos bajos)
• Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta
  claro,
• no compacto

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Leucocitos
polimorfonucleares
Tienen una vida media de 2-3 dias En humanos
constituyen el 60-70 de los leucocitos totales
de la sangre. No muestran ninguna especificidad
para los antígenos pero desempeñan un Importante
papel en la inflamación aguda

• Neutrófilo
• Citoplasma acidófilo color rosa pálido (con
  eosina ácida se tiñe de amarillo).
• Tiene granulaciones neutrofílicas chicas ,
  regularmente distribuidas, abundantes pueden ser
  primarios o secundarios
• Nucleo multilobulado
• 10-20um de diametro

• Eosinófilo
• Citoplasma acidófilo con granulaciones acidófilas
  grandes, menos númerosas que en neutrofilos,
  distribución regular y muy
• refringentes
• Núcleo bilobulado en forma de anteojos, violeta
  oscuro y compacto.

• Basófilo
• Citoplasma acidófilo o antófilo (no toma
  colorante)
• granulaciones basófilas grandes,poco númerosas,
  distribución irregular de color azul violeta
  intensos.
• Núcleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta
  oscuro y compacto

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Tinción de leucocitos en frotis
Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar
Coloración ideal
May Grunwald (azul de metileno/eosina)
Tiñé citoplasma y granulaciones
Giemsa (azul de metileno/eosina y azur)
Tiñé el núcleo
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Tipos celulares
Neutrófilos
Eosinófilos
Basófilos
Punción cardíaca
Sangre periférica
Frotis
Monocitos
Linfocitos
Fórmula leucocitaria (en humanos)
En rata, el de linfocitos es mayor al de
neutrófilos (la relación se invierte)
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Fórmula leucocitaria

• Para determinar el porcentaje de los diferentes
  tipos celulares se cuenta un número fijo de
  células por frotis (por ejemplo 100),
  diferenciando los tipos celulares siguientes
  linfocito, macrófago y granulocitos.
• La diferenciación celular se basa en la relación
  del tamaño núcleo/citoplasma, la morfología del
  núcleo y la coloración que adquiere el
  citoplasma.
• Barrer el preparado en guarda griega porque las
  células no se distribuyen homogéneamente
  linfocitos en franja central, monocitos y
  polimorfos nucleares en el borde.
• Las proporciones de la fórmula leucocitaria
  varían según
• Edad
• especie (humanos predominan los neutrófilos,
  rata predominan los linfocitos)

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Recuento de células

• Determinación de la concentración de células en
  una suspensión
• cámara de Neubauer

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Separación de poblaciones celulares

• Un método eficiente debe reunir
• Buena recuperación
• Alta pureza
• Mantenimiento de la funcionalidad celular

Sirven para enriquecer o depletar una población
de células
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Métodos basados en tamaño y densidad
Velocidad de sedimentación a 1 x g Ley de Stokes
Fuerza de fricción experimentada por objetos
esféricos moviéndose en un fluido viscoso en un
régimen laminar de bajo número de Reynolds (Relt
2000). Una célula que sedimenta obedeciendo la
Ley de Stokes (en general es válida para
partículas pequeñas moviéndose a velocidades
bajas), llega a una velocidad terminal dada por
Densidad de la célula
Densidad del medio
Radio de la célula
Constante gravitacional
Viscosidad del medio
La temperatura puede modificar la velocidad de
sedimentación alterando la viscosidad
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Densidad celular
El diámetro influye más que la densidad de la
célula en la determinación de la velocidad de
sedimentación
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• Separación en base al tamaño principalmente
  (medio de baja densidad)
• Ventajas
• Buena reproducibilidad
• Buena recuperación
• Puede separar una gran cantidad de células
• Desventaja
• Tiempo requerido para la separación

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• Separación en base a la densidad
• Centrifugación en gradiente de densidad
• ?utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta
  desde la zona superior a la inferior.
• ?el gradiente se consigue con un soluto
  preferiblemente de baja masa molecular en un
• solvente en el que la muestra a analizar puede
  ser suspendida
• ?permite separar los componentes de una muestra
• ?realizar medidas analíticas
• Dos variantes
• Centrifugación zonal la muestra se deposita
  en la parte superior de un gradiente
• de densidad preformado. Bajo fuerza
  centrifuga las partículas sedimentan moviéndose
• a diferentes velocidades dependiendo de su
  masa.
• Centrifugación isopícnica la muestra se
  disuelve en una sn en donde está el soluto
• formador del gradiente. Durante la
  centrifugación el soluto se distribuye en el tubo
  y las
• particulas de la muestra se reorientan de
  acuerdo a su densidad. (sedimentación a altas
• g a través de un medio cada vez más denso)

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Cuando la densidad del medio y de las células
son iguales, entonces v 0 y la célula flota en
una posición de equilibrio. Las células muy
densas llegan al fondo del tubo y pueden morir
por compresión. Las células muertas también son
muy densas y llegan al fondo del tubo. Se
utilizan altas g para alcanzar más rápido el
equilibrio y evitar mezclas por efectos de
difusión. Cuanto mayor es la relación núcleo
citoplasma, mayor es la densidad de la
célula Medio hipotónoico células menos densas
medio hipertónico células más densas Se
utilizan gradientes de BSA lineales o
discontinuos y sílica gel coloidal, Percoll.
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Separación en base a tamaño y densidad
(Hypaque-Ficoll) Separación de una suspensión
celular a través de un medio de alta densidad por
centrifugación a baja velocidad Ficoll. Se trata
de un polisacárido sintético de alto peso
molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido
en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena
solubilidad en medios acuosos. Además no presenta
grupos ionizables que puedan servir de unión a
las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino,
pudiendo ser autoclavado sin degradarse. Su
viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque
sigue siendo algo elevada, lo que supone un
inconveniente y no altera la presión osmótica del
medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha
utilizado para la separación de células y
partículas subcelulares mediante centrifugación
zonal. Densidad del medio para células
humanas 1,075 g/cm3

ratón 1,09 g/cm3
rata
1,089 g/cm3
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El dextran es un polisacárido complejo y
ramificado formado por muchas moléculas de
glucosa unidades en cadenas de longitud variable
(de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones
glucosídicas a1-gt6 entre moléculas de glucosa,
mientras que las ramificaciones empiezan en
uniones a1-gt4 (en algunos casos también en
uniones a1-gt2 y a1-gt3). El dextrano es
sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas
bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc
mesenteroides y Streptococcus mutans).
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Separación de células sanguíneas humanas por
centrifugación en gradiente de Percoll

• Gradiente de Percoll (50-70 ) Buena
  recuperación y pureza mayor al 90
• Percoll.
• Se trata de una suspensión de partículas (5.15
  nm) de ácido silícico revestidas de un derivado
  de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que
  presenta baja viscosidad a densidades altas, no
  afecta prácticamente a la presión osmótica del
  medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y
  10.
• Es soluble en solución acuosa y estable en ellas
  siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato),
  especialmente a bajos pH.
• El compuesto puede ser utilizado para
  centrifugaciones zonales, preformando gradientes,
  o bien para centrifugación isopícnica, ya que la
  centrifugación de percoll en rotores angulares
  durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce
  un ligero gradiente, independientemente de la
  densidad inicial del percoll.

Cuando la densidad del medio y de las células son
iguales, entonces v 0 y la célula flota en una
posición de equilibrio.
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Métodos basados en adherencia

• 3 categorías
• 1- Adherencia activa Requiere del metabolismo
  celular y es temperatura dependiente (ej
  macrófagos, polimorfonucleares)
• 2- Adherencia física Se puede realizar a 4 C o
  a 37 C (ej subsets de células B)
• 3- Adherencia de células muertas o dañadas
• Sustancias empleadas
• Sephadex G10 Quedan retenidas las células
  adherentes.
• La separación se
  basa en adherencia y tamaño.
• Polvo de hierro (Carbonyl iron powder) Las
  células que fagocitan o se adhieren a las
  partículas de hierro, son removidas con un imán.
  (ej Remoción de linfocitos B)
• Lana de nylon Se utiliza para obtener células T
  libres de células B.
• El rendimiento es
  bajo (15 a 25 ).
• Puede haber retención
  diferencial de subpoblaciones T.
• Adherencia a superficies de vidrio o plástico

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Métodos basados en afinidad (Interacción
receptor-ligando)
Rosetas Columnas con anticuerpos Panning
superficies plásticas recubiertas con anticuerpo
Beads magnéticas Aglutinina de maní
interacciona con residuos D-galactosa de
timocitos inmaduros, aglutinando las células (las
células maduras presentan éstos residuos
enmascarados por ácido siálico. Aglutinina de
soja aglutina células B pero no células T. FACS
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Métodos basados en afinidad
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Técnicas inmunomagnéticas
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Receptor de la superficie celular que se combina
con un ligando (basado en la especificidad de la
interacción) Antisuero complemento
Eliminación de una subpoblación que lleva un
antígeno de membrana específico.
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Otros métodos de separación
Método basado en filtración por columna de
bolitas de vidrio 53 a 65 µ de diámetro Las
células más grandes se retrasan con respecto a
las más pequeñas. El vidrio debe estar
siliconado Metodo basado en carga eléctrica
neta En roedores hay una distribución bimodal de
movilidades correspondiendo a células B y T. En
humanos esa distribución no se puede
correlacionar con las poblaciones B y T
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Métodos basados en la separación funcional por
inactivación de células proliferantes 1- Pulso
de timidina marcada con radioisótopos Linfocitos
expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la
timidina se incorpora al ADN La desintegración
radioactiva mata las células proliferantes. (Reacc
iones mixtas de linfocitos, respuestas
citotóxicas mediadas por células).
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2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR) Se
incorpora al ADN en células en división como
análogo de la timidina. Cuando se activa con luz
UV, causa el daño del ADN. 3-
Mitomicina C Causa cross-linking del ADN y las
funciones que requieren división celular son
abolidas 4- Irradiación Rayos X, Cobalto (60Co),
Cesio (137Cs), rayos gamma.
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