Introduccin del DNA en clulas vivas

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Introducción del DNA en células vivas
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Temas

• Trasformación el proceso de introducir DNA en
  bacterias.
• Identificación de recombinantes.
• Introducción de fagos e identificación de
  recombinantes.
• Introducción de DNA en otras células

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Trasformación el proceso de introducir DNA en
bacterias

• El proceso de transformación. Descripción.
• En qué fenómenos se basa el proceso.
• Las células de bacteria tienen que ser
  competentes.
• Una vez que el protocolo ha terminado, es
  necesario seleccionar las células
  transformadas, también llamadas
  transformantes (0,01).
• Entre las transformantes, debemos de seleccionar
  las recombinantes.

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Sistemas de Selección
Origen rep.
Sitio de corte o polilinker
Primer marcador Ampicilina
Segundo marcador Tetraciclina o LacZ
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Tipos de células posibles

• Células desprovistas de plásmido Amp- Tet
• Células provistas de plásmido Amp Tet
• Células provistas de plásmido cargado Amp Tet
  
• Células provistas de plásmido cargado con el gen
  de interés Amp Tet- y positivas en otras
  pruebas específicas.

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Introducción de fagos e identificación de
recombinantes

• El método de la transfección
• (transformación infección).
• El método del empaquetamiento in vitro

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Empaquetamiento in vitro

• Cepa de bacteriófago ? A mutada en una etapa de
  la fase lítica. Resultado lisado de bacterias
  con todos los componentes menos el factor
  A.Tratada con DNAasa, fracción protéica.
• Cepa de bacteriófago ? B mutada en otra etapa de
  la fase lítica. Resultado lisado de bacterias
  con todos los componentes menos el factor
  B.Tratada con DNAasa, fracción protéica.
• Constructo del bacteriófago lambda preparado por
  técnicas de biología molecular, y aislado como
  DNA circular.
• Se mezclan los trés componentes en un tubo y se
  incuban.
• Al juntarse, los dos complementos protéicos de
  los dos bacteriófagos se complementan y
  empaquetan el DNA en capsidias normalmente.
• Las zonas de infección se visualizan como placas
  o calvas.

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Placas de Bacteriófago ?
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Identificación de fagos recombinantes

• Inactivación por inserción del gen lacZ. El gen
  lacZ codifica la ß-galactosidasa. Un número de
  fagos ? y M13 contienen este gen con sitios de
  corte en su seno (polilinker). Al insertarse el
  DNA, la actividad se elimina.
• La actividad se puede detectar empleando el
  indicador X-gal.

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Placas de ? con el gen lacZ