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Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad
de Ciencias Biológicas Programa de Doctorado en
Ciencias Biológicas Mención Genética Molecular y
Microbiología
SEMINARIO DEPARTAMENTAL Estudio de la
biogénesis de MicroRNAs y su rol en la
regulación del desarrollo en Arabidopsis
thaliana
FELIPE AQUEA Z. JUNIO 2003
2
RNAs NO CODIFICANTES
RNAs COMO BIORREGULADORES
Science, 2002
3
MicroRNAs
-RNA simple hebra 22 nucleótidos -Procesado
desde un precursor -Codificado en los genomas de
eucariontes superiores -Sus secuencias son
complementarias a RNA mensajeros -Función
Regular negativamente la expresión genética
en eucariontes
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LOS MicroRNAS SE ENCUENTRAN EN DIVERSOS
ORGANISMOS
5
MicroRNAs IDENTIFICADOS EN PLANTAS
- 100 MicroRNAs Identificados a la
fecha -Identificados en Arabidopsis-Maíz-Arroz
y Tabaco
Reinhart, B.J., Genes Dev. 16, 1616-1626 (2002).
Llave C., Plant Cell 14, 1605-1619 (2002). ,
6
EXPRESIÓN TEJIDO-ESPECÍFICO DE LOS MicroRNAs
SiSilicua
FFlores
St Tallo
L hojas
SePlantulas
Reinhart, B.J., Genes Dev. 16, 1616-1626 (2002).
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MUTACIONES EN PHV Y PHB ALTERAN EL PATRÓN
RADIAL (EJEMPLO DE REGULACIÓN)
NORMAL
MUTANTE
Fenotipo Adaxialización de las hojas
McConnell, J.R, Nature 411709-713 (2001).
Rhoades, M., Cell 110513-520 (2002)
8
MODELO MECANISMO DE ACCIÓN DE MicroRNAs
Rhoades, M. Cell 110513-520 (2002)
9
BIOGÉNESIS DE MicroRNAs EN CÉLULAS HELA
Lee Y.,EMBO J 21(17)4663-70 (2002)
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EL ROL DE MicroRNAs DURANTE EL DESARROLLO
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MUTANTES CAF PRESENTAN FENOTIPO ALTERADO
-Reducción en el tamaño de la planta -Hojas más
pequeñas y deformes -Alteración de los meristema
Reinhart, B.J., Genes Dev. 16, 1616-1626
(2002) Jacobsen SE . Development 126(23)5231-43
(1999)
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MUTANTES ARGONAUTA PRESENTAN FENOTIPO ALTERADO
42 días
11 días
35 días

• Generación tallo único (sin ramificaciones)
• -Hojas sin diferenciación adaxial/abaxial
• -Inflorescencia anormal
• -Flores infértiles
• -Órganos filamentosos

42 días
Bohmert K., EMBO J 17(1)170-80 (1998)
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CAF Y AGO PARTICIPAN EN LA MISMA VÍA
-EVIDENCIAS GENÉTICAS EN C.elegans -SIMILITUD
DEL FENOTIPO DE PLANTAS MUTANTES
Golden, t., Plant physiology 130808-822 (2002)
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FENOTIPO MUTANTE HASTY

• Reducción tamaño órganos y meristema apical
• -Retardo inducción floral
• -Adaxialización de hojas y carpelos
• -Fertilidad reducida
• - Fenotipo similar a plantas mutantes caf y ago

Mutante HASTY
Bollman KM, Development 130(8)1493-504 (2003).
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HASTY ES HOMÓLOGO A EXPORTINA 5
Homología de secuencia Receptor de transporte
núcleo-citoplasma tipo exportina xpo5 de mamífero
Bollman KM, Development 130(8)1493-504 (2003).
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EXPORTE NUCLEAR DE RNA DOBLE HEBRA MEDIADO POR
EXPORTINA 5
Adenovirus VA1
XPO5 interactúa con VA1
( Gel de retardo)
Gwizdek C, J Biol Chem 278(8)5505-8 (2003)
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RESUMEN
-Plantas mutantes en Dicer y Argonauta no se
detecta la presencia de MicroRNAs maduros y
presentan alteraciones en su fenotipo -Plantas
mutantes en el receptor de transporte
núcleo-citoplasma HASTY presenta alteraciones en
el fenotipo similar a plantas mutantes en Dicer y
Argonauta -El gen homólogo a HASTY de mamífero
transporta RNA de doble hebra (similar al
precursor de los MicroRNA)
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HIPÓTESIS
El gen HASTY codifica para la exportina
involucrada en el transporte núcleo-citoplasma
de MicroRNAs en Arabidopsis thaliana.
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Objetivo general Caracterizar la biogénesis de
MicroRNAs y su transporte nucleocitoplasmático a
través de la exportina HASTY
Objetivos específicos 1.- Determinar el
intermediario del MicroRNA que es exportado del
núcleo 2.- Demostrar que el exporte nuclear de
MicroRNAs en Arabidopsis thaliana es mediada por
HASTY
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Objetivos específicos
OBJETIVO 1 Determinar el intermediario del
MicroRNA que es exportado del núcleo. OBJETIVO
2 Demostrar que el exporte nuclear de MicroRNAs
en Arabidopsis thaliana es mediada por
HASTY 2.1.-Determinar la capacidad de HASTY de
unir MicroRNAs. 2.2-Determinar la capacidad de
HASTY de exportar MicroRNAs. 2.3.-Caracterizar
el transporte de MicroRNAs en mutantes HASTY.
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OBJETIVO 1 Determinar el intermediario del
MicroRNA que es exportado del núcleo
ENSAYO DE PROTECCIÓN A RNASA EN FRACCIONES
SUBCELULARES
Sonda 40 nt
MicroRNA 39
5
3
Precursor mir163 (70nt)
(40 nt)
(22 nt)
Mir 163 maduro (22nt)
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ENSAYO DE PROTECCIÓN A RNASA
-Generación de protoplastos (células
vegetales) -Fraccionamiento subcelular -Extracción
RNA -Ensayo protección RNAsa
MicroRNA de expresión constitutiva
RNA Total Núcleo Citoplasma
levadura RNAsa T1
-
Sonda
Pre-mir163
mir 163 maduro
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OBJETIVO 2 Demostrar que el exporte nuclear de
MicroRNAs en Arabidopsis thaliana es mediada por
HASTY 2.1.-Determinar la capacidad de HASTY de
unir MicroRNAs. Unión in vitro Geles de
Retardo Unión in vivo Inmunoprecipitación de
complejos
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GEL DE RETARDO
Sonda fría
Sonda HASTY
complejo
Sonda Libre
Competidores sonda mutante y t-RNA
Sonda marcada
25
INMUNOPRECIPITACIÓN HASTY
-Extracto nuclear de plantas -Precipitación
anticuerpo anti-HASTY -Tratamiento con
proteasa -Análisis PAGE
Input - Ip HASTY
70
Precursor
26
OBJETIVO 2 Demostrar que el exporte nuclear de
MicroRNAs en Arabidopsis thaliana es mediada por
HASTY 2.2-Determinar la capacidad de HASTY en el
exporte de pre-MicroRNAs.
-Microinyección de HASTY y pre-MicroRNA en
ovocito de Xenopus
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Microinyección de HASTY y pre-MicroRNA en ovocito
de Xenopus
15 minutos
Tiempo 0
Control Hasty
T N C T N C T N C
T Total N Núcleo C Citoplasma
U6 Pre-mir39 t-RNA
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OBJETIVO 2 Demostrar que el exporte nuclear de
MicroRNAs en Arabidopsis thaliana es mediada por
HASTY 2.3.-Caracterizar el transporte de
MicroRNAs en mutantes HASTY.
-Extracción RNA Total y nuclear -Análisis
Northern blot
Mutante HASTY
29
Northern Blot
Planta Normal
Planta mutante HASTY
T N
T N
70
Precursor
22
MicroRNA maduro
30
CONCLUSIONES

• HASTY puede interactuar con el intermediario del
  procesamiento de MicroRNA
• -HASTY puede participar en el transporte
  núcleo-citoplasma del intermediario de MicroRNA
• -En plantas mutantes en HASTY no se detecta la
  presencia de MicroRNAs maduros.
• -El fenotipo de estas plantas se debe a la
  desregulación de la expresión de genes del
  desarrollo.

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MODELO DE BIOGÉNESIS DE MicroRNA EN PLANTAS
Transcripción precursor
Factor de exporte citoplasmático
NÚCLEO
CITOPLASMA
Maduración MicroRNA
Regulación post-transcripcional
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(No Transcript)
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POTENCIALES BLANCOS PARA MicroRNAs EN PLANTAS
MicroRNA FAMILIA DE PROTEINAS BLANCO
miR156 Proteínas de unión al
promotor Squamosa miR159 Proteínas MYB
(LEAFY) miR160 Factores de respuesta a
auxinas miR165 Factores de transcripción
HD-Zip miR168 ARGONAUTA miR170 SCARECROW miR1
72 APETALA 2 miR 174 Putativo gen de
resistencia a patógenos
Rhoades, M. Cell 110513-520 (2002)
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EXPRESIÓN DE mir39 Y GENES SCARECROW
mir 170
Llave C., Science 2972053-6(2002)
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OBJETIVO 3 Identificar genes en Arabidopsis
thaliana que sean regulados indirectamente por
HASTY 3.1.- Encontrar mutantes que reviertan o
aumenten el fenotipo
Doble mutante
Mutación al azar por inserción de T-DNA
Doble mutante
Planta Normal
HASTY
36
MicroRNAs
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SILENCIAMIENTO GÉNICO