Title: PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Cuantificaci
1PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de
Proteínas
2Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and
M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem.
177 751-766, 1949
- El método de Biuret se basa en la reacción de
sales de Cu2 con moléculas que contienen más de
dos enlaces peptídicos en un medio alcalino el
cobre es reducido a Cu formando complejos color
púrpura que tienen un máximo de absorción a 540
nm. El método se usa para soluciones que tienen
de 0.5 a 10 mg proteína/ml. - Es un método poco sensible. Es útil cuando se
quiere analizar grandes lotes de proteína. - Existen compuestos que interfieren con la
lectura, tales como tioles y sales de amonio, que
pueden removerse precipitando la proteína con un
volumen igual de ácido tricloroacético al 10,
resuspendiendo el precipitado que contiene las
proteínas en NaOH 1 N.
3Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr,
and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193 265. 1951
- El color producido por el método de Lowry resulta
de la reacción de Biuret sobre los enlaces
peptídicos, además de la reducción del reactivo
de fosfomolibdato-fosfotungstato
(Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas
con cobre en medio alcalino. - El Cu y los grupos R de la tirosina, triptofano
y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin,
produciendo un producto inestable que es reducido
a azul de molibdeno/tungsteno. - El color azul, es determinado a 650 nm.
- Este es un método muy sensible, por lo que
permite trabajar con soluciones muy diluídas de
proteínas (0.02 - 0.5 mg proteína/ml).
4Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal.
Biochem. 72, 248
- El método de Bradford de basa en que el Azul
Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a
azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina
en las proteínas. - El complejo proteína-colorante tiene un
coeficiente de extinción elevado, lo que le
confiere gran sensibilidad. - La reacción entre el colorante y la proteína es
muy rápida (aproximadamente 2 min), y el completo
proteína-colorante permanece disperso en solución
por un tiempo relativamente largo. - Rango de detección 0.5-10 mg proteína/ml.
5Absorción Ultravioleta de las Proteínas
- La mayoría de proteínas presenta un máximo de
absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de
aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y
fenilalanina). - La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir
proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5
mg/ml, en la ausencia de sustancias que
interfieran con la lectura. - Algunas preparaciones de proteínas parcialmente
purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los
cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm. - Una ecuación para calcular la concentración de
proteína en la presencia de ácidos nucleicos en
cubetas de 1 cm de paso es - (proteína)mg/ml 1.55 A280nm - 0.76 A260nm
- La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260
1.75) en la presencia de ácido nucleico de
levadura (A280/A260 0.49) y por tanto puede no
ser precisa para otras proteínas y otros ácidos
nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una
solución de proteína 0.1 (p/v) varía entre 0.5 y
2.5, dependiendo de la proporción de aminoácidos
aromáticos que contengan.
6Absorción Ultravioleta de las Proteínas
- Todas las proteínas absorben fuertemente debajo
de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina
(0.1 p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215,
respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La
absorbancia por debajo de 230 nm es debido al
enlace peptídico. - Consecuentemente los valores de A 0.1 son casi
los mismos para todas las proteínas.
Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a
100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de
absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva
standard graficando A vs. proteínas. - (proteína)ug/ml 144 (Acm215 - Acm225)
- La diferencia de absorbancia es usada para
minimizar errores que resulten de compuestos no
proteicos en solución. Altas concentraciones de
ciertos buffers pueden interferir (no se puede
usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5
mM NaOH no causa problemas).