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La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II et GSK-3 Béta Régulent Jun .
Découverte des Jun Kinases IV. Les Kinases de
Stress JNK et p38 . Activation des JNKet p38,
les protéines rac/cdc42 et MEK . Le Facteur de
Transcription NF-KB V. Spécificité de la Voie des
MAP Kinase . Les Problèmes Posés . Les
Protéines Scaffold
2
Cascading Kinases
The raf Mek-1 Erk-1 cascade is one example
of a MAP kinase cascade. A number of these
cascades have been described, and although they
utilise specific kinases, the pathways are very
similar
Growth Factor
Stress
Cytokines
MAP kinase kinase kinase
Serine/threonine kinase
MAP kinase kinase
Dual-specificity kinase
Serine/threonine kinase
MAP kinase
3
End-point of MAPK signalling
4
Les Récepteurs Transmembranaires
Extracellular ligand-binding domain
. La Plupart des ligands ne peuvent pas passer la
membrane plasmique. Ces signaux utilisent des
récepteurs transmembranaires . Partie
Extracellulaire Fixation du Ligand . Partie
Intracellulaire Transmission du Signal
outside
Plasma membrane
inside
Transmembrane domain
Intracellular domain couples to next step (may
have enzymatic activity)
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Les Grandes Voies de Signalisation

• Récepteur tyrosine kinase
• Les Récepteurs à 7 domaines Transmembranaires
• Récepteur Nucléaire
• Voie de Signalisation Hedgehog
• Voie de Signalisation Wnt
• Voie du TGF-béta
• JAK/STAT
• Notch

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Les Grandes Voies de Signalisation
7 Domaines
Tyr Kinases

• Un domaine transmembranaire
• Ligands Protéines
• Signalisation via des kinases et GTPases
• intracytoplasmiques
• Dimérisation du Récepteur

• Ligandsprotéines, peptides, Lipides
• Signalisation via les G-protéines et
• seconds messagers. PKC
• Pas de dimérisation

Récepteurs aux Antigènes
Récepteurs Canaux Ioniques

• Activation par Fixation dun Antigène
• . Kinases, GTPases et seconds
• Messagers.
• Dimérisation du Récepteur

• Plusieurs domaines transmembranaires
• Signalisation faisant suite au Passage
• des Ions
• Le Ligand permet louverture du Canal

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La Transmission de lInformation
Modification
Cible
Activation
Inhibition
Tyr Ser Thr
PHOSPHORYLATION PO4-
kinase
phosphatase

• Les Modifications
• Protéiques
• Laddition réversible dun groupement induit un
  changement de conformation
• Cette conformation entraîne un changement de
  localisation et dactivité.
• Cette signalisation Requiert des Enzymes pour
  induire puis inhiber lactivation

Tyr Cys
Nitro- hydrolase
S-NITROSYLATION NO
S-nitrosylase
GLYCOSYLATION
Variées
Plusieurs
Plusieurs
LIPID Farnesyl Prenyl Geranyl Myristoyl etc
Variées
Plusieurs
Plusieurs
Dé- acétylases
ACETYLATION
lysine
Acétylases
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Messagers
Exemples

• 2. Les Second Messagers
• Interagissent directement avec leur
• cible pour modifier leur activité
• Mobiles et stables

Calcium Zinc, Mn 2
Ions
DAG PIPs, IPs
Lipides
Nucléotides Cycliques
cAMP, cGMP
Gaz dissous
Nitric Oxyde (NO)
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LExample de la Phosphorylation

• Les Kinases Phosphorylent, les Phosphatases
  Déphosphorylent
• Les Cibles sont soit des Sérines, soit des
  Thréonines, soit des Tyrosines

Ser/Thr Kinases
Tyr Kinases

• Environ 450 Kinases dans le Génôme Humain
  (kinome)

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Activation Membranaire Les Problèmes Posés
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Activation Membranaire Les Problèmes Posés
Domaines d Interactions
Réponse Cellulaire
Pas de Réponse
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Les Modules dInteraction Protéiques
Les Domaines SH2
Les Domaines Src-homology 2 (SH2) sont des
Modules de 100 acides aminés qui fixent des
peptides contenant des tyrosines phosphorylées.
Les 5 acides aminés C-terminaux permettent la
Spécificité. Laffinité Phosphopeptide -SH2 est
de 50-500nM
Les Domaines SH3
Les Domaines Src-homology 3 (SH3) fixent des
peptides contenant des Prolines selon la séquence
consensus Pro-X-X-Pro. Chaque Proline fixe une
poche hydrophobique au sein du domaine SH3 pour
un Kd de lordre du µM.
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Configuration Tridimensionnelle Récepteurs/Domaine
SH2
Jaune Récepteur Rouge Phosphate
(portée par la Tyrosine) Blanc Domaine SH2
Le Phosphate Est Une Charge Négative Qui Vient
s Insérer Dans une  Poche  Positive Présente
dans le Domaine SH2
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Les Modules dInteraction Protéiques
Les Bromodomaines
Dune Taille approximative de 110 acides aminés,
le bromodomaine est situé sur les protéines
associées à la chromatine. Ce domaine permet
linteraction avec des lysines acétylées.
Les Domaines PH
Les domaines PH, Pleckstrin-homology (PH), sont
trouvés sur les régulateurs qui sassocient avec
les membranes. Certains permettent une
interaction forte (Kd nM) avec des
phosphoinositides spécifiques. Ils permettent la
relocalisation du médiateur sur les membranes.
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Recrutement des co-Activateurs Importance du
Bromodomaine
Activation
Acétylation
Acétylation
Régulateur (Swi/Snf)
L Acétylation Permet le Recrutement De
co-Activateurs qui se Fixent sur Les Lysines
Acétylées via leur Bromodomaine
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Les Domaines PH
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La PI3-Kinase Phosphoryle Les Lipides Membranaires
PI3 kinase (p110)
PI3 kinase (p110)
PI3 Kinase est Composée de deux Sous-Unités p85
Sous Unité Régulatrice p110 Sous Unité
Catalytique
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Activation de la Protéine Kinase Akt
La Phosphorylation des Lipides Sous Membranaire
Crée des Points d Ancrage Pour Akt/PKB
L interaction Avec les Lipides Membranaires Se
Fait par un Domaine Pleckstrin Ou Domaine PH
La Kinase PDK1 est Egalement Recrutée à La
Membrane PDK1 Phosphoryle et Active Akt/PKB
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Activation de la Protéine Kinase Akt
L interaction Avec les Lipides Membranaires Se
Fait par un Domaine Pleckstrin Ou Domaine PH
L interaction Avec les Lipides Membranaires
Entraîne un Changement de Conformation de Akt et
Permet son Activation par PDK1
Nature 2001, 411355
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La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II et GSK-3 Béta Régulent Jun .
Découverte des Jun Kinases IV. Les Kinases de
Stress JNK et p38 . Activation des JNKet p38,
les protéines rac/cdc42 et MEK . Le Facteur de
Transcription NF-KB IV. Spécificité de la Voie
des MAP Kinase . Les Problèmes Posés . Les
Protéines Scaffold
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Les Récepteurs à Activité Tyrosine Kinases
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
PDGF-? PDGF-? CSF-1R KIT/SCFR FLK2/FLT3
VEGFR1/FLT1 VEGFR2/KDR/FLK1 VEGFR3/FLT4
EGFR ERBB2/HER2/neu ERBB3 ERBB4
FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4
IR IGF-1R IRR
MET RON SEA
TRKA TRKB TRKC
AXL/UFO MER TYRO3
EPHA1 EPHA2 EPHA3 EPHA4 EPHA5 EPHA6 EPHA7 EPHA8 EP
HB1 EPHB2 EPHB3 EPHB4 EPHB5 EPHB6 EPHB7
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Activation et Dimérisation
. Le récepteur est en équilibre avec une forme
inactive. La fixation du ligand stabilise le
récepteur sous sa forme active, ce qui déclenche
son activité tyrosine kinase.
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Activation de la Voie des MAP Kinases
24
La Cascade des MAP Kinases
Johnson Lapadat (2002) Science 298 1911
25
La Cascade des MAP Kinases est Conservée dans
Différentes Espèces
lin-3
Mammalian
let-23
C. Elegans
sem-5
let-341
let-60
lin-45
mek-2
Chardin et. al. (1993) Science 260 1338
mpk-1
VanAelst et. al. (1993) PNAS 90 6213
Han et. al. (1993) Nature 363 133
Warne et. al. (1993) Nature 364 352
Vojtek et. al. (1993) Cell 74 205
26
La Cascade des MAP Kinases est Conservée dans
Différentes Espèces
Levure
27
Les MAP Kinases Sont Impliquées dans des Voies de
Signalisation Différentes
Neuronal Differentiation
Proliferation
York et. al. (1998) Nature 392 622
Marshall (1998) Nature 392 553
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Mutations de Ras et Tumeurs
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Components of Ras-dependent Signaling Pathways
Implicated in Human Cancer
Growth factor
B
r
e
a
s
t

c
a
.
Receptor
Plasma
RAS
Membrane
C
o
l
o
n

c
a
.
NF1
S
c
h
w
a
n
n
o
m
a
PI3-K
O
v
a
r
i
a
n

c
a
.
B-Raf
M
e
l
a
n
o
m
a
Harmatomas
P
r
o
s
t
a
t
e

c
a
.
PTEN
TSC1/TSC2
Akt
G
a
s
t
r
i
c

c
a
.
MAPK/ERK2
B
r
e
a
s
t

c
a
.
mTOR
Survival Motility
Proliferation Differentiation
30
L Activation du Récepteur Induit Son
Autophosphorylation Intracytoplasmique
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Activation de Ras par Sos Transfert de GTP sur
Ras-GDP
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La Famille des Protéines GTPases Ras
Ras Rho Rab Arf Ran
Rab1-N
Arf1-6
Ran
H-Ras N-Ras K-Ras TC21 Rap1 Rap2 R-Ras RalA Ra
lB
RhoA RhoB RhoC RhoG RhoE CDC42 Rac1 Rac2
Transport Nucléaire
. Ras est le Membre Fondateur dune Famille de
plus de 70 GTPases . Très conservée les 164
acides aminés du ras humain et poulet ne
diffèrent quà deux positions . La Conservation
Témoigne de Fonctions Essentielles à la Cellule.
Cytosquelette Migration
Prolifération Différenciation
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Les Cycles dEchange
La signalisation repose sur des Cycles de .
Phosphorylation et Déphosphorylation par les
kinases Et phosphatases . Echange GTP/GDP par
Les Facteurs dEchange

• Les Protéines G
• - Fixent et hydrolisent le GTP
• Trimérique
• - Sous-Unités a, b, et g
• a fixe le GTP

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Les Cycles dEchange GTP/GDP de Ras
Ras-GTP
H2O
GTP
Hydrolysis
Exchange
Pi
GDP
Ras-GDP
35
Les Cycles dEchange GTP/GDP de Ras
Ras-GTP
H2O
GTP
GTPase Activating Proteins (GAPs)
Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs)
Pi
Ras-GDP
GDP
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Les Formes Mutantes de Ras dans les Tumeurs
Activation Constitutive de Raf
Ras-GTP
GTP
Activité GTPase non Fonctionnelle Dans Certains
Types Tumoraux
Exchange
Ras-GDP
GDP
37
Les Cycles dEchange GTP/GDP de Ras
SOS
ON
OFF
p120GAP
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Activation de Ras par SOS/GTP

• Sos se Fixe sur les Régions Switch 1 et 2 de
  Ras-GDP
• LInsertion dune hélice alpha de Sos déplace S1
  du site de fixation du GTP/GDP
• Le GDP Diffuse, laissant la place pour le GTP
  qui prend la Place

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Sos-Ras