Prsentation PowerPoint

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Principe de de la résonance plasmonique de
surface
Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée
monochromatique illumine une interface entre deux
milieux d'indice de réfraction différent, une
partie de la lumière incidente est réfléchie sur
l'interface et l'autre partie de la lumière est
réfractée à travers la surface.
Lumière polarisée monochromatique
Lumière réfléchie
Air
Plaque de verre
Liquide
Lumière réfractée
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Principe (suite)
Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la
lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas
de réfraction, une des composantes
électromagnétiques de la lumière, l'onde
évanescente, se propage perpendiculairement à
l'interface sur une distance équivalente à sa
longueur d'onde.
Lumière polarisée monochromatique
Lumière réfléchie
Air
Q

Liquide
Onde évanescente
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Principe (suite)
Si une couche fine de métal, riche en électrons
libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent
en résonance avec les photons du faisceau
incident, ce phénomène est appelé résonance
plasmonique de surface. Une conséquence
énergétique de cette résonance est visible dans
le faisceau réfléchi qui, analysé avec une
barrette de diodes présente une chute d'intensité
à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum
est l'angle de résonance. Il varie en fonction de
l'indice de réfraction du milieu présent dans le
champ évanescent.
Lumière polarisée monochromatique
I
Barette de diodes
Lumière réfléchie
Air
Qi
Plaque de verre
Q
Film dor

Liquide
Onde évanescente
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Principe de fonctionnement du Biacore
Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps
réel des interactions entre biomolécules non
marquées dans un débit continu de tampon.
Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière
spécifique sur une interface appelée sensor chip
(biocapteur).
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Le sensorgramme.
L'analyte dilué dans un tampon circule à flux
constant à la surface du biocapteur. Les
changements de masse induits par l'association ou
la dissociation des complexes modifient la
réfringence du milieu et décalent la position de
l'angle de résonance.L'enregistrement de la
variation de l'angle de résonance permet de
suivre en temps réel la fixation des molécules
injectées sur le biocapteur. Le signal de
résonance est exprimé en unités de résonance
(RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un
sensorgramme.
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Le cycle danalyse en temps réel
7
Le cycle danalyse
8
Le cycle danalyse
Phase dassociation
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Le cycle danalyse
Analyte Ligand Complexe
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Le cycle danalyse
Phase de dissociation
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Le cycle danalyse
Analyse Mathématique
Analyse cinétique de La liaison analyte - ligand
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Le cycle danalyse
Phase de régénération
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Interactions en Temps Réel par BIACORE
Molécules concernées protéines, acides
nucléiques, sucres, lipides, petites molécules,
drogues, peptides cellules, particules virales...
Applications majeures Constantes daffinités
(KD10-4 -10-12 M) et cinétiques (ka, kd)
Concentration active dun analyte Cartographie
épitopique Validation de molécules
recombinantes Détection de molécules (milieux
complexes) Etude paramétrique Micropurification
et récupération
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Nature Biotechnology  21, 71 - 76 (2003)
Rational design of a CD4 mimic that inhibits
HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization
epitopesLoïc Martin1, François Stricher1,
Dorothée Missé2, Francesca Sironi3, Martine
Pugnière4, Philippe Barthe5, Rafael Prado-Gotor5,
Isabelle Freulon1, Xavier Magne2, Christian
Roumestand5, André Ménez1, Paolo Lusso3,
Francisco Veas2  Claudio Vita1
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Interaction protéine-virus HIV
MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par
synthèse peptidique à partir dun fragment de
toxine de scorpion donnant les caractéristiques
structurales du CD4 Objectifs de l étude
Etude des interactions entre gp120 et miniCD4
Démontrer que miniCD4 peut démasquer des
épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la
gp120 native BIACORE
Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière
M, Barthe P, Prado-Gotor R, Freulon I, Magne x,
Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C.
(2003). Nat Biotechnol 21(1) 71-6
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STRUCTURE DU VIH
core
gp120
enveloppe
P7 (nucléocapside)
gp41
P24 (capside)
intégrase
P17 (matrice)
RT
ARN
protéase
90 à 120 nm
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HIV Lifecycle
Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 552-61, 2004
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Entrée du virus dans la cellule 1re étape du
cycle de réplication virale
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• Interaction
• entre le complexe trimérique
• de lenveloppe
• et le récepteur CD4
• modification conformationnelle de la gp120 et
  de la gp41
• augmentation de 100 à 1 000 fois de laffinité
  pour le corécepteur

Cellules infectées ou exprimant des protéines
de lenveloppe virale
Glycoprotéinesde lenveloppe
VIH
CD4
CCR5 ou CXCR4 (corécepteur)
Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur
CROI 2003 - Daprès E. Hunter, Birmingham,
abstract 118, actualisé
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Les différentes étapes déclenchant la fusion
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Fixation au corécepteur Fin de la
modification conformationnelle de lenveloppe
Formation dune structure en épingle à
cheveux, hélicoïdale avec rapprochement des
membranes Initiation de la fusion des membranes
lipidiques
Attachement cellulaire non spécifique
Fixation au récepteur CD4 Initiation de la
modification conformationnelle de lenveloppe
Cellule cible
Corécepteur
CD4
gp120
gp41
Virus
Étapes possibles du blocage de lentrée
3. Inhibition de la modification conformationnell
e de la gp41 (fusion)
1. Inhibition de la fixation au CD4
2. Inhibition de la fixation au corécepteur
- Daprès E. Hunter, Birmingham, abstract 118,
actualisé
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Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex
CD4
gp120
Blue glycosylation sites
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STRATEGIES ANTI-VIH bloquer les étapes
Inhibiteurs de la fusion
Inhibiteurs de la RT
Analogues nucléosidiques Non nucléosidiques
Inhibiteurs de lintégrase
Inhibiteurs de la transcription
ARNm
Inhibiteurs de lassemblage
Inhibiteurs de protéase
GC/VIH/99
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Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui
inhibe lentrée de HIV dans la Cellule
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Interaction protéine-virus HIV
interaction gp120 sur CD4M33 immobilisé
Les gp120 se lient au CD4M33
Interactions Moléculaires en Temps Réel (M.
Pugnière, F. Roquet) CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val
dAurelle
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(No Transcript)
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Conclusions
--Elles amènent une quantification de laffinité
mais surtout des données cinétiques. -Etude des
interactions à plus de deux partenaires -Etude
paramétrique de ces interactions -Méthode
applicable à grand nombre de molécules et aux
interactions complexes -Récupération possible