Les microarrays, vue densemble et applications Frdric Bassilana

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Les micro-arrays, vue densemble et
applicationsFrédéric Bassilana
I - Notions fondamentales
II - Des arrays aux biopuces
III - Traitement de linformation biologique
2
I - Notions fondamentales
3
Notions fondamentales
Organismes
Organes
Tissus
Cellules
Noyau
Gènes
4
Chromosomes humains en métaphase
5
Des chromosomes aux gènes - I
6
Des chromosomes aux gènes - II
Daprès Watson et Crick (Nature 1953)
7
Des chromosomes aux gènes - III
8
Des chromosomes aux gènes - IV
9
Deux grandes phases
Noyau
Cytoplasme
Cellule
Membrane
10
Une complexité croissante
11
La transcription
12
Des gènes aux proteines
TSS
TES
Enhancer / Repressor
Enhancer / Repressor
Intron 2
Intron 1
Intron 3
Intron 4
Intron 5
Promoter
PAS
ADN (2 brins) A, T, C, G
Exon1
2
Exon3
4
Exon5
AATAAA
TATA box
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La transcription - II
14
La transcription - III
ARN pré-messager
1
2
3
4
5
15
La traduction
16
La traduction
AAAAAAAAA
17
Le code génétique
18
Lhybridation
19
Lhybridation
Taille différente
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Principes de détection des acides nucléiques
Southern Blot
Southern, E.M. Detection of specific sequences
among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503517 (1975).
21
Principes de détection des acides nucléiques
Northern Blot
ARNm
Foie
Coeur
Rein
Taille
Membrane de nylon
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Paramètres de lhydridation
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Résumé
Membrane
Noyau
Cytoplasme
Cellule

• On postule quun modification transcriptionnelle
  va avoir un impact sur une fonction

• Les acides nucléiques sont complémentaires (AT,
  CG)

• Lefficacité dhybridation dépend notamment de
  la température et de la longueur de lalignement
  exact.

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II - Des arrays aux Biopuces
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Quelques chiffres
Séquencé Mb Chromosomes Gènes Saccharomyces
cerevisiae 1996 12 I-XVI 6 103 Caenorhabditis
elegans 12 / 1998 100 I-V X 20
103 Drosophila melanogaster 04 / 2000 135 3
XY 14 103 Arabidopsis thaliana 12 /
2000 120 I-V 26 103 Homo sapiens 02 /
2001 3300 22 XY 23 à 50 103 Mus
musculus 2004 3000 19 XY 25 à 94 103
http//www2.ebi.ac.uk/genomes/mot/
http//www.ensembl.org/
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Pourquoi les arrays sont-ils nécessaires
Connu
ARNm
Foie
Coeur
Rein
Taille
A tester
Membrane de nylon
27
Principe
28
Les 2 grandes étapes
A - Matérielle (dépôt, sondes, hybridation,
scanner)
B - Traitement du signal
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A - Etape  matérielle 
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Le design des sondes

• Trois possibilités

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Une longueur idéale ?
Hugues et al APRIL 2001 VOLUME 19 nature
biotechnology
32
Les supports

• Sur filtre de nylon

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Le dépôt
La densité augmentant, le problème est de déposer
les sondes

• Au bon endroit

• En quantité contrôlée

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Dépôt avec contact
Synthèse
Dépôt
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Dépôt sans contact / Synthèse in situ
Technologie  Jet dencre 

• Dépôt

• In situ

Sonde Oligonucléotide (60), cDNA
Lame 25mm X 75mm
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Synthèse in situ
Photo-déprotection

• In situ

Sonde Oligonucléotides (25)
12.8mm X 10mm
37
Le marquage
38
Distance à la matrice accessibilité
PEG
Oligonucléotide
40 angströms
Southern et al, nature genetics supplement
volume 21 january 1999
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Structure secondaire disponibilité

• Les fragments testés peuvent former des
  structures secondaires

40
Conditions optimales
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Lhybridation

• Taille de la sonde

• cDNA 500 - 5000 bases

• Oligonucléotide 20 - 60 bases

• Taille et type de léchantillon

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Acquisition des données
I - Pellicule photographique
43
Deux grands principes
44
II - Traitement du signal
45
Traitement de limage
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Quelques problèmes classiques
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Le principe  Affymetrix 

• Après traitement de limage il y a 22 à 32
  valeurs par échantillon

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Test de spécificité
Libre
50
C
Tm
49
Qualification dun  probe set  - I
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
PM
MM
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
50
Qualification dun  probe set  - II
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Calcul de la valeur dexpression

•  One-Step Tukeys Biweight Estimate 

• Le bruit de fond est calculé en prenant en
  compte tous les MM  CT 

• Par paire, on calcule log (PM - MM) ou log (PM -
  CT) si MM gt PM

• Cette valeur est pondérée en considérant sa
  distance à la médiane du probe set

• Le signal est la moyenne de toutes ces valeurs
  exprimée de façon linéaire

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Tableau de résultats
P-value
 Call 
Valeur
Clé
1345434_at
0.0001
P
1228
._at
0.23
A


A
M
X 104 entrées
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Les systèmes à 2 canaux

• Après traitement de limage il y a une valeur
  par échantillon, mais lon sintéresse
  généralement au rapport de la valeur des deux
  échantillons

• Le déséquilibre Cy3 / Cy5, bien que mieux pris
  en compte aujourdhui rend souvent nécessaire
  un swap 

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III - Traitement de linformation biologique
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Evolution des publications sur les Biopuces
Multiplexed biochemical assays with biological
chips Fodor et al Nature 1993 Aug
5364(6437)555-6
Light-generated oligonucleotide arrays for rapid
DNA sequence analysis Pease AC et al Proc Natl
Acad Sci U S A 1994 May 2491(11)5022-6
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Bibliographie de Biopuces
Trouvé dans Medline en Août 2003
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La préparation des données
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Comparaison en paire
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Interprétation

• Linterprétation se fait souvent par recoupement
  dinformations

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Comparaison de plusieurs groupes
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Les signatures comme une alternative aux voies
métaboliques
 Cluster 
Dépend de la distance (Euclidienne, Manhatan,
min, max )
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Le  clustering  hiérarchique dEisen
Eisen et al., PNAS vol95 14863 - 14868, 1998
63
Classification
Echantillon1
 n  échantillon présentant une histologie
similaire
Référence
Echantillon2
64
Classification
65
Ce nest quun début
66
Une nouvelle ambition
Organismes
Organes
Tissus
Cellules
Voies métaboliques
Noyau
Réseaux
Gènes
67
Les réseaux
R lt -r0
R gt r0
68
Les réseaux
69
Comment intégrer toutes ces données ?
Expérience
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Un effort international
Japon
CIBEX
http//cibex.nig.ac.jp/cibex/HTML/index.html
USA
Gene Expression Omnibus (NCBI)
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
ArrayExpress (EBI)
Europe
http//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/
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Il faut se méfier des apparences

• Il faut donc multiplier les angles dobservation
  pour approcher la  réalité 

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La confirmation par une technique alternative est
un bon indicateur
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Il faut bénéficier des autres informations
disponibles
Expérience - Conditions de lexpérience -
Données dexpression
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Conclusions
Clinique
Préclinique
Optimisation
HTS
Recherche